Ensaios de proliferação e viabilidade celular
- Ensaios de proliferação celular de síntese de DNA
- Ensaios de proliferação metabólicos
- Ensaios de viabilidade celular luminescentes
- Ensaios de proliferação de corante fluorescente
- Cultura de células 3D – coloração tripla de células vivas/mortas/totais
- Contagem de células com azul de tripano
Introdução
Ensaios para medir a proliferação celular, a viabilidade celular e a citotoxicidade são comumente usados para monitorar a resposta e a saúde celular em culturas após o tratamento com vários estímulos. A escolha adequada de um método de ensaio depende do número e do tipo de células usadas, bem como do resultado esperado. Os ensaios de proliferação celular podem monitorar o número de células ao longo do tempo, o número de divisões celulares, a atividade metabólica ou a síntese de DNA. Contagem celular usando corantes de viabilidade, como azul de triptano ou Calceína-AM, podem fornecer tanto a taxa de proliferação como a porcentagem de células viáveis.
Visão geral dos ensaios de proliferação e viabilidade celular
| Nome | Visão geral | Método de detecção | Vantagen | Desvantagen |
|---|---|---|---|---|
| Ensaio BrdU | O BrdU se incorpora ao DNA recém-sintetizado e é detectado com o uso do anticorpo anti-Brdu | ICC, IHC, FACS, ELISA | Cinética do ciclo celular, resolução de célula única | Protocolo longo Danos potenciais ao DNA |
| Ensaio EdU | Semelhante à técnica BrdU, mas usa a detecção por química do clique sem anticorpos | ICC, IHC, FACS, ELISA | Menos tóxico que o BrdU Protocolo mais rápido Sem desnaturação do DNA | Reagentes caros |
| Ensaio MTT | O MTT, um tetrazol amarelo, é reduzido a formazan roxo em células vivas | Espectrofotômetro | Protocolo rápido Alta produtividade | Ensaio de ponto final Superestimação da viabilidade Etapa final de solubilização |
| Ensaio XTT | As células com respiração ativa convertem o XTT em um produto formazan laranja solúvel em água | Espectrofotômetro | Alta sensibilidade Grande faixa dinâmica Solúvel em água | Ensaio de ponto final Superestimação da viabilidade |
| Ensaio WST-1 | O WST-1 é clivado em formazan solúvel por um mecanismo celular complexo que ocorre principalmente na superfície celular. | Espectrofotômetro | Maior sensibilidade Protocolo mais rápido | Ensaio de ponto final Superestimação da viabilidade |
| Ensaio de ATP luminescente | Ensaio baseado em células de luciferase de pirilampo para quantificar o ATP em culturas de células; usado para medir a viabilidade celular | Espectrofotômetro | Sensível Rápido Compatível com alto rendimento | Requer lise celular |
| Ki67 | Os anticorpos para a proteína nuclear Ki-67 podem ser usados para medir a proliferação celular. | ICC, IHC, WB | Aplicações in vivo | Difícil de quantificar Requer fixação |
| CFSE | O CFSE, um corante permeável à célula não fluorescente, é clivado por esterases intracelulares para emitir fluorescência verde. | ICC, FACS | Análise de células vivas Experimentos longos Compatível com linfócitos | Toxicidade Emissão de canal verde |
| Ensaios de organismos vivos/mortos | Coloração fluorescente simultânea de células viáveis, mortas e totais usando calceína-AM (células vivas), iodeto de propídio (PI, células mortas) e Hoechst 33342 (células totais). | ICC, FACS | Análise de células vivas Protocolo rápido Resolução de célula única | Autofluorescência de fundo |
| Azul de triptano | Teste de exclusão de corante: as células viáveis não absorvem o corante, mas as células mortas são permeáveis a ele | Microscopia | Baixo custo Protocolo rápido | Variabilidade imprecisa |
Ensaios de proliferação celular de síntese de DNA
Ensaio de proliferação celular BrdU
A proliferação celular pode ser estudada pelo monitoramento da incorporação de um radioisótopo, [3H]-timidina, no DNA celular, seguido de autorradiografia. Como alternativa, a 5-bromo-2′-deoxi-uridina (ensaios de BrdU) pode ser usada em vez da timidina. As células que incorporaram BrdU em seu DNA são facilmente detectadas usando um anticorpo monoclonal contra BrdU e um anticorpo secundário conjugado com enzima ou fluorocromo.
Figura 1.A, Células em proliferação no olho do embrião de galinha E4 usando corante BrdU B, Validação do anticorpo anti-BrdU usando camptotecina. Ao tratar as células Jurkat com o agente de parada do ciclo celular camptotecina, as células circulantes ficam presas na transição da fase G1/S.
Ensaios de proliferação com EdU
Os ensaios de proliferação de EdU Baseclick fornecem um método eficiente para a detecção de fluorescência do DNA em replicação. O nucleosídeo modificado EdU é adicionado a células vivas e é incorporado ao DNA replicante. A química de clique induzida por Cu permite a rápida ligação de sondas fluorescentes ao EdU. Isso proporciona uma maneira quantitativa de monitorar as células que estão se proliferando. Os ensaios estão disponíveis em vários formatos para imagens microscópicas, citometria de fluxo, triagem de alto rendimento e para experimentos in vivo. Quatro sondas fluorescentes diferentes com excitação de pico de 488, 555, 594 e 647 estão disponíveis para a capacidade de multiplexação com outras sondas fluorescentes.
Figura 2.Os kits de proliferação celular Edu-Click incorporam EdU (5-etinil-2'-deoxiuridina) no DNA durante a síntese ativa de DNA e são medidos usando um método de detecção por química do clique fluorescente.
Ensaios de proliferação metabólicos
Ensaios quem medem a atividade metabólica são adequados para analisar a proliferação, viabilidade e citotoxicidade. A redução de sais de tetrazólio, como MTT, XTT e WST-1 em compostos de formazan coloridos ou a biorredução da resazurina ocorre somente em células metabolicamente ativas. As células que proliferam ativamente aumentam sua atividade metabólica, ao passo que as células expostas a toxinas terão sua atividade reduzida.
Ensaios de proliferação celular com MTT
O MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazólio; azul de tiazolil) é um sal de tetrazólio solúvel em água que produz uma solução amarelada quando preparado em meios ou soluções salinas sem vermelho de fenol. O MTT dissolvido é convertido em um formazan roxo insolúvel pela clivagem do anel de tetrazólio por enzimas desidrogenase. Esse formazan insolúvel em água pode ser solubilizado usando isopropanol ou outros solventes, e o material dissolvido é medido espectrofotometricamente usando a absorbância como uma função da concentração do corante convertido.
Ensaios de proliferação celular com XTT
Em contraste com o MTT, o produto de clivagem do XTT é solúvel em água; portanto, não é necessária uma etapa de solubilização. O sal de tetrazólio XTT é clivado em formazan por um mecanismo celular complexo. A biorredução ocorre somente em células viáveis e está relacionada à produção de NAD(P)H por meio da glicólise. A quantidade de corante formazan formado está diretamente correlacionada ao número de células metabolicamente ativas na cultura.
Ensaios de Proliferação Celular WST-1
O sal de tetrazólio estável WST-1 é clivado em formazan solúvel por um mecanismo celular complexo que ocorre principalmente na superfície celular. Essa biorredução é amplamente dependente da produção glicolítica de NAD(P)H em células viáveis. A quantidade de corante formazan formado está diretamente correlacionada ao número de células metabolicamente ativas na cultura.
Guia de Protocolo: Ensaio WST-1 para viabilidade e proliferação celular. Protocolos, perguntas frequentes e resolução de problemas
Figura 3.O ensaio MTT é um ensaio colorimétrico para avaliar a proliferação celular com base na atividade metabólica. As enzimas de oxidorredutase celular dependentes de NAD(P)H refletem o número de células viáveis presentes. Essas enzimas são capazes de reduzir o corante amarelo de tetrazólio MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio brometo a seu formazan insolúvel, que tem uma cor púrpura.
Ensaios de viabilidade celular luminescentes
Como o ATP é um indicador de células metabolicamente ativas, o número de células viáveis pode ser avaliado com base na quantidade de ATP disponível. O Ensaio de luciferase de viabilidade celular ATP oferece um ensaio homogêneo altamente sensível para quantificar o ATP em culturas de células. Esse kit utiliza a luciferase do pirilampo para oxidar a D-Luciferina e a produção resultante de luz para avaliar a quantidade de ATP disponível nas culturas de células. O procedimento de ensaio sensível envolve uma única adição do coquetel de detecção de ATP diretamente às células cultivadas em um meio suplementado com soro. Não é necessário lavar as células, remover o meio ou pipetar várias vezes. O kit é sensível o suficiente para a detecção de uma única célula ou 0,01 picomoles de ATP. O sinal produzido é linear em seis ordens de magnitude. Ao relacionar a quantidade de ATP ao número de células viáveis, o ensaio tem amplas aplicações, que vão desde a determinação do número de células viáveis até a proliferação e a citotoxicidade celular.
Figura 4.Ensaio de viabilidade celular de ATP luciferase bioluminescente. O uso de ATP pela luciferase do pirilampo para oxidar a D-Luciferina e a produção resultante de luz para avaliar a quantidade de ATP disponível que se correlaciona com o número e a viabilidade da célula.
Ensaios de proliferação de corante fluorescente
Marcação com CFSE
O éster N-sucinimidílico de diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína (CFSE) é uma escolha popular para medir o número de divisões sofridas por uma população celular. Quando entra na célula, o CFSE é clivado por esterases intracelulares para formar o composto fluorescente, e o grupo éster succinimidílico reage de modo covalente com aminas primárias em proteínas intracelulares. Após a divisão, a intensidade fluorescente de cada célula gerada é dividida pela metade, permitindo a simples detecção do número de divisões celulares por citometria de fluxo. O CFSE tem sido amplamente utilizado para medir a proliferação de linfócitos, inclusive células T.
Coloração dupla de células vivas/mortas
A coloração dupla de células vivas/mortas pode ser utilizada para a detecção simultânea de fluorescência de células viáveis e mortas. A calceína-AM é um corante altamente lipofílico e permeável à membrana celular. Embora a própria calceína-AM não seja uma molécula fluorescente, a calceína gerada a partir da calceína-AM pela esterase em uma célula viável emite uma forte fluorescência verde (λex 490 nm, λem 515 nm). Portanto, a calceína-AM só cora células viáveis. Por outro lado, o corante de coloração de núcleos de iodo de propídio não consegue atravessar a membrana de uma célula viável. Ele chega ao núcleo passando por áreas desordenadas da membrana celular morta e se intercala com a dupla hélice do DNA para emitir fluorescência vermelha (λex 535 nm, λem 617 nm). Como a calceína e o DNA com IP podem ser excitados com luz de 490 nm, o monitoramento simultâneo de células viáveis e mortas é possível com um microscópio de fluorescência de excitação única.
Figura 5.Coloração dupla de células vivas/mortas
Cultura de células 3D – coloração tripla de células vivas/mortas/totais
O Kit de imagem de viabilidade celular é um ensaio de três cores que pode ser usado com culturas de células 2D e 3D para a coloração de fluorescência simultânea de células viáveis (Calcein-AM), células mortas (Iodeto de propídio/PI) e células totais (Hoechst 33342).
- A calceína-AM fluoresce em verde ao se ligar ao cálcio, dependendo da atividade da esterase presente apenas em células viáveis metabolicamente ativas.
- O iodeto de propídio (PI) é um corante nuclear que é excluído pela membrana das células vivas, mas atravessa a membrana danificada das células mortas, intercalando-se com o DNA para emitir uma forte fluorescência vermelha.
- O Hoechst 33342 é um corante de coloração de DNA que apresenta baixa citotoxicidade. Ele fluoresce em azul e é usado como um indicador da contagem total de células.
Contagem de células com azul de tripano
O azul de triptano é um dos vários corantes recomendados para uso em procedimentos de exclusão de corantes para contagem de células viáveis. Esse método baseia-se no princípio de que as células vivas (viáveis) não absorvem o corante azul, enquanto as células mortas (não viáveis) o fazem. A viabilidade celular pode ser calculada usando a razão entre o total de células vivas/total de células (vivas e mortas). A coloração também facilita a visualização da morfologia geral das células.
OBSERVAÇÃO: O azul de tripano tem uma afinidade maior pelas proteínas séricas do que pelas proteínas celulares. Se o fundo estiver muito escuro devido à presença de soro na matriz, as células devem ser aglomeradas e suspendidas novamente em meio sem proteína ou solução salina antes da contagem.
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Referências
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