Determinação da oxidação de fosfolipídios por espectroscopia UV/VIS - Avanti^® Polar Lipids

Definição

A porcentagem de oxidação de um fosfolipídio pode ser determinada usando a Lei de Beer para calcular a concentração do fosfolipídio peroxidado a partir de sua absorbância em 234 nm.

Escopo

Aplicável a todos os fosfolipídios insaturados.

Equipamentos

• Espectrofotômetro UV/VIS
• Célula de amostragem de quartzo HELLMA UV (QS 1.000)
• Lenços de limpeza Kimwipes
• Tubos de vidro descartáveis

Reagentes

• Etanol (200 provas, desidratado USP)
• Água desionizada
• 16:0 PC (DPPC)

Procedimento

1. Prepare a amostra DPPC. Prepare um mínimo de 3 ml de uma solução de 1 mg/ml de DPPC dissolvido em etanol/água DI (9:1).
2. Prepare a amostra. Prepare um mínimo de 3 ml de uma solução de 1 mg/ml da amostra de fosfolipídios dissolvida em etanol/água DI (9:1).
3. Execute a amostra em branco. A amostra em branco (fundo) é o solvente usado para dissolver as amostras de fosfolipídios.
   • Enxágue a célula de amostra com o solvente três vezes para remover quaisquer contaminantes residuais da célula.
   • Preencha 3/4 da célula de amostra com a referência.
   • Use um lenço de limpeza Kimwipe para limpar todas as impressões digitais e contaminantes na parte externa da célula de amostra.
   • Insira a célula de amostra no espectrofotômetro e execute um espectro em branco.
4. Execute a amostra DPPC.
   • Despeje o solvente em branco fora da célula de amostra.
   • Preencha 3/4 da célula de amostra com a solução de amostra DPPC.
   • Remova as impressões digitais da parte externa da célula de amostra.
   • Insira a célula de amostra no espectrofotômetro e execute um espectro de DPPC.
5. Execute a amostra.
   • Despeje a amostra DPPC na célula de amostra.
   • Enxágue a célula de amostra com o solvente três vezes para remover qualquer DPPC residual da célula.
   • Preencha 3/4 da célula de amostra com a amostra de fosfolipídio.
   • Remova as impressões digitais da parte externa da célula de amostra. Insira a célula de amostra no espectrofotômetro e execute um espectro de amostra.
   • Subtraia o espectro de DPPC do espectro da amostra e registre a leitura da absorção (OD) da amostra de fosfolipídios em 234 nm.

Cálculos

Concentração de lipídio peroxidado (D) = A/(B*C)
A = Leitura da absorção (OD) a 234 nm
B = Coeficiente de extinção em (OD*ml)/(mmol*cm) (27.000 para lipídio peroxidado)
C = Comprimento do caminho em cm Porcentagem de oxidação = D/E * 100
D = Concentração de lipídio peroxidado em mg/ml
E = Concentração da amostra de lipídio = 1,0 mg/ml

Referências

1. Kim R, LaBella F. 1987. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid Res. 28:1110-1117.