Pular para o conteúdo
Merck

Measuring the activity of protein variants on a large scale using deep mutational scanning.

Nature protocols (2014-08-29)
Douglas M Fowler, Jason J Stephany, Stanley Fields
RESUMO

Deep mutational scanning marries selection for protein function to high-throughput DNA sequencing in order to quantify the activity of variants of a protein on a massive scale. First, an appropriate selection system for the protein function of interest is identified and validated. Second, a library of variants is created, introduced into the selection system and subjected to selection. Third, library DNA is recovered throughout the selection and deep-sequenced. Finally, a functional score for each variant is calculated on the basis of the change in the frequency of the variant during the selection. This protocol describes the steps that must be carried out to generate a large-scale mutagenesis data set consisting of functional scores for up to hundreds of thousands of variants of a protein of interest. Establishing an assay, generating a library of variants and carrying out a selection and its accompanying sequencing takes on the order of 4-6 weeks; the initial data analysis can be completed in 1 week.

MATERIAIS
Número do produto
Marca
Descrição do produto

Sigma-Aldrich
Ácido clorídrico, ACS reagent, 37%
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Ácido acético, glacial, ACS reagent, ≥99.7%
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Trizma® base, Primary Standard and Buffer, ≥99.9% (titration), crystalline
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Hidróxido de sódio, ACS reagent, ≥97.0%, pellets
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Cloreto de magnésio, ACS reagent, 99.0-102.0%
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Ácido bórico, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5%
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
DL-Ditiotreitol, ≥99.0% (RT)
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Millipore
Yeast Nitrogen Base Without Amino Acids and Ammonium Sulfate, suitable for microbiology, NutriSelect® Basic
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
GenElute HP Plasmid Midiprep Kit, sufficient for 25 purifications
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Ampicilina
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade
Sigma-Aldrich
Biotina, ≥99% (HPLC), lyophilized powder
SKU
Tamanho da embalagem
Disponibilidade
Preço
Quantidade