Standardprotokoll für die reverse Transkription (Zweischritt)

Reverse Transkription

Die reverse Transkription (RT) ist der Prozess der Umwandlung von RNA in cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptase-Enzyms und dNTP.

Der RT-Schritt kann mit der gesamten RNA durchgeführt werden, sodass eine globale cDNA erzeugt wird, die für alle RNA-Transkripte in der Probe repräsentativ ist (in der Regel über ein zweistufiges Protokoll), oder in einem genspezifischen Ansatz, bei dem nur die RNA von Interesse in cDNA umgewandelt wird (in der Regel nach einem einstufigen Protokoll).

Die folgenden Versuche können als Basis-RT-Protokolle eingesetzt werden, die je nach Bedarf abgeändert werden können. Üblicherweise wird cDNA entweder in einem zweistufigen Verfahren mit anschließender Verdünnung der cDNA vor der Zugabe zur PCR/qPCR hergestellt oder es wird eine einstufige Reaktion vorbereitet, bei der beide Verfahren nacheinander durchgeführt werden.

Ausrüstung

• Standard PCR-Gerät oder Heizblock
• Laminar-Flow-Werkbank für RT-Setup (optional)

Reagenzien

• RNA (Stammlösung ca. 1 μg/μl).
• ReadyScript^® zweistufiges Kit für die cDNA-Synthese (RDRT). Alternative Kits für die reverse Transkription können auch in Verbindung mit Oligo-dT-Primern und/oder Zufallsprimern verwendet werden.
• Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden.

Materialien

• Sterile Filter-Pipettenspitzen
• Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)
• PCR-Röhrchen und -Platten. Treffen Sie ihre Auswahl, um das gewünschte Format zu erhalten:
  • Einzelne dünnwandige 200-μl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
  • Platten
  - 96-Well-Platten (Z374903)
  - 384-Well-Platten (Z374911)
  • Plattendichtungen oder Kappen
  - ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)
  - ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)

Methode

Vorbereitung

1. ReadyScript® Kit-Komponenten und RNA-Proben auf Eis legen.
2. Mischen und dann kurz zentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens aufzufangen.

Reaktion

1. Bestimmen Sie die Anzahl der erforderlichen Reaktionen, einschließlich der Kontrollen. Berechnen Sie die Volumen der einzelnen Komponenten, die für alle Reaktionen benötigt werden (erlauben Sie einen Zuschlag von 10 % für Pipettierfehler), und kombinieren Sie die Reagenzien gemäß Tabelle P10-26 unter Verwendung von 0,2 ml-Röhrchen oder einer 96-Well-Platte, die auf Eis liegt. Wenn Sie eine PCR-Platte verwenden, folgen Sie einem Plattenschema, um sicherzustellen, dass die Reagenzien in die richtigen Wells gegeben werden.

Tabelle P10-26. ReadyScript^® Reaktions-Mastermix für die cDNA-Synthese

Reagenz	Volumen (μl) pro 20 μl-Einzelreaktion
ReadyScript® cDNA-Synthese-Gemisch (5× RT-Mischung)	4
Gesamt-RNA-Template - variabel (1 μg bis 10 pg)	1
Wasser in PCR-Qualität	15

2. Nach dem Versiegeln jeder Reaktion wird der Inhalt mit einem Vortex vorsichtig gemischt. Zentrifugieren Sie kurz, um die Bestandteile am Boden des Reaktionsgefäßes zu sammeln.
3. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung gemäß Tabelle P10-27.

Tabelle P10-27. ReadyScript^® cDNA-Synthesereaktion Temperatur-Inkubationsprofil

Temperatur (°C)	Zeit (Min)
25	5
42	30
85	5
4	Halten

4. Nach Abschluss der cDNA-Synthese 1:5 bis 1:10 der Erststrangreaktion (2-4 μl) für die PCR-Amplifikation verwenden.  
   Hinweis: Bei Verwendung von ReadyScript^® Reagenzien können 2-4 μl unverdünnte cDNA zur PCR hinzugefügt werden, ohne dass es zu einer Hemmung kommt. Falls gewünscht, kann das cDNA-Produkt mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 0,1 mM EDTA verdünnt und bei -20 °C gelagert werden.