Applicazioni della reazione a catena della polimerasi (PCR)

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica fondamentale in biologia molecolare e costituisce un metodo in vitro rapido ed efficiente per amplificare con enzimi sequenze specifiche di DNA o RNA di provenienze diverse. Una PCR standard prevede un DNA bersaglio, una serie di primer oligonucleotidici sintetici complementari alle sequenze fiancheggianti la sequenza bersaglio del DNA, una DNA polimerasi termostabile (di solito Taq polimerasi) e nucleotidi. Utilizzando i termociclatori, ogni ciclo di amplificazione prevede tre passaggi: la denaturazione del DNA a doppio filamento (dsDNA) in DNA a singolo filamento, l’ibridazione dei primer con la sequenza bersaglio del DNA e l’estensione, in cui la DNA polimerasi estende il DNA a partire dai primer creando un nuovo dsDNA composto da un filamento vecchio ed uno nuovo. I filamenti sintetizzati in un ciclo servono da stampo per quello seguente col risultato che in appena 20 cicli la quantità di DNA aumenta di un milione di volte.  

RT-PCR (PCR a trascrittasi inversa)

La RT-PCR, o PCR a trascrittasi inversa, è una variante della PCR standard che comporta l’amplificazione di specifici mRNA a partire da quantità limitate di campione. Elimina la necessità del passaggio di purificazione dell’mRNA richiesto nelle tecniche di clonaggio convenzionali. Nella RT-PCR la trascrittasi inversa e un campione di RNA vengono aggiunti ai reagenti della PCR standard. La miscela di reazione è scaldata a 37 ˚C per consentire alla trascrittasi inversa di produrre una copia di cDNA complementare all’RNA campione. Questo cDNA si appaia in seguito con uno dei primer e porta alla sintesi del primo filamento. Da qui si prosegue con una PCR standard che porta alla produzione di dsDNA. La RT-PCR è spesso associata alla PCR in tempo reale (qPCR), che ha lo scopo di quantificare il livello di trascritti presenti in cellule e tessuti.

PCR Hot Start

La PCR Hot Start (con partenza a caldo) è una tecnica in cui l’attività della hot start Taq polimerasi, o l’incorporazione di dNTP modificati, vengono inibite durante la fase di preparazione della reazione, finché non avviene l’attivazione per esposizione al calore. Sono disponibili vari metodi per inibire l’attività della hot start polimerasi, incluse modificazioni chimiche o metodi basati sull’uso di anticorpi o aptameri. 

PCR endpoint per amplificazione lunga e accurata del bersaglio

La PCR endpoint è spesso impiegata per rilevare la presenza di DNA bersaglio e la relativa abbondanza al completamento della reazione. La limitata lunghezza delle sequenze che è possibile ottenere mediante una PCR standard, circa 5 kb, è ovviata in parte incorporando fattori addizionali dotati di attività di correzione degli errori. Una PCR lunga e accurata (LA) prevede l’uso di una seconda polimerasi termostabile con attività esonucleasica 3′→5′ in grado di riparare eventuali errori nell’incorporazione terminale dei nucleotidi col risultato di aumentare in modo significativo la fedeltà e la possibilità di amplificare dei DNA bersaglio di lunghezza fino a 40 kb.

Articoli tecnici correlati

• Troubleshooting PCR and RT-PCR Amplification
  This page shows PCR and RT-PCR amplification troubleshooting.
• Digital PCR
  Digital PCR is an end-point PCR method that is used for absolute quantification and for analysis of minority sequences against a background of similar majority sequences, e.g., quantification of somatic mutations.
• Ethidium Bromide
  Ethidium bromide is a well-known and widely used fluorescent dye in biotechnology research.
• Polymerase Chain Reaction
  The polymerase chain reaction is one of the most widely used techniques in molecular biology. The PCR process consists of three main steps, Denaturation, Annealing & Extension
• Hot Start PCR
  The purpose of Hot Start PCR is to inhibit the PCR reaction in order to reduce nonspecific amplification, prevent the formation of primer dimers, and increase product yields.
• Visualizza tutto (58)

Protocolli correlati

• Protocollo per PCR standard
  Tutti i passaggi del protocollo per la PCR standard, parametri dei cicli ed elenco dei reagenti Questo metodo per amplificare il DNA mediante una normale PCR si avvale dalla Taq DNA polimerasi standard.
• Annealing Oligonucleotides Protocol
  Annealing is the process of heating and cooling two single-stranded oligonucleotides with complementary sequences.
• Oligonucleotide Melting Temperature
  Learn about methods for calculating oligonucleotide melting temperature (Tm).
• PCR/qPCR/dPCR Assay Design
  The entire PCR workflow is vulnerable to factors which introduce variability. Many of the variable components are unavoidable, such as the source of the sample or the requirement for a reverse transcription step. Assay design is also highly variable and can make the difference between PCR success and failure and also contributes to the reproducibility and sensitivity of an assay.
• REDExtract-N-Amp™ Tissue PCR Kit Protocol
  The exrract-N-Amp kit protocol provides a rapid DNA extraction method that leads to a PCR-ready sample in 15 minutes. Optimized PCR ReadyMix yields successful and clean amplification. RED loading dye allows for sample tracking.
• Visualizza tutto (59)

Cerca altri articoli e protocolli

Digita le parole chiave