親和層析標記蛋白質的疑難排解指南

以下故障排除指南針對本章討論的大多數純化產品的共通問題，以及特定方法的特殊問題進行了說明。

有关更多产品特定的故障排除，请参阅产品随附的说明。

Problem	Possible Cause	問題
色譜柱或平板孔阻塞。 或 離心時液體未完全移除（SpinTrap 色譜柱）。 OR 流速太慢（GraviTrap 柱）。	存在細胞碎片。	在下一次上样前优化样品预处理。离心和/或将样品通过 0.22 或   0.45 µM 过滤器。按照 Appendix 1 (Characteristics of Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON Superflow, and uncharged IMAC Sepharose products).如果原位清洗 (CIP) 不成功，請更換培養基/預製柱。
	由于物质浓度过高或存在大的核酸分子（可能表现为背压增加），样品过于粘稠。	增加機械細胞破壞的效率（例如、增加聲納時間）。將樣本保持在冰上，避免起泡和過熱，因為這可能會使目標蛋白變性。在裂解前增加細胞糊的稀釋，或在裂解後稀釋以降低黏度。如果裂解液因宿主核酸濃度過高而非常黏稠，可繼續進行細胞破壞，直到黏稠度降低，和/或加入額外劑量的 DNase 和 Mg2+ （DNase I 至 5 µg/mL，Mg2+ 至 1 mM），並在冰上培養 10 至 15 分鐘。或者，用注射器針頭抽取裂解液幾次。冷凍/解凍未解凍的裂解液可能會增加沉澱和聚集。對解凍的裂解液進行機械裂解，可避免上柱時背壓增加的問題。如果純化是在 4 °C 下進行，請盡可能移至室溫（樣品黏度在室溫下會降低）。上樣時降低流速。
	蛋白難以溶解或在純化過程中沉澱。	首先，篩選適合的溶解條件；變更 pH 值、離子強度、蛋白濃度、去垢劑或其他可能影響蛋白溶解度的添加劑。可使用下列添加劑：最高 1%NP-40、1% CHAPS、1.0 M NaCl、20% 甘油、10 mM β-巯基乙醇、1 至 3 mM DTT 或 DTE（最高可達 5 mM，但取決於樣品和樣品體積）。輕輕攪拌 30 分鐘以幫助標籤蛋白溶解 請注意，NP-40（但不包括濃度達 1%的 Tween™-20）在 280 奈米處有較高的吸光度。此外，去垢劑不容易透過緩衝液交換去除。包涵體：蛋白質通常可以利用一般的變性劑如 4 至 6 M 瓜-HCl、4 至 8 M 尿素或強去垢劑來溶解（和展開。請參閱 Chapter 10, 處理包涵體。
純化的餾分中沒有組氨酸標記蛋白或低產量。	起始材料中沒有組組氨酸標記蛋白、
	鎳離子被剝離。	如果樣品導致剝離，例如組氨酸標記蛋白被分泌到真核細胞培養上清液中，則改用 Ni Sepharose excel。 3D 模式 专为提供极精简与友善操作接口的BIOS环境所设计，技嘉独特的3D模式，提供完全互动且说明详尽的图形接口，用户能够轻松且直觉性的调整UEFI BIOS设定，以获得优化性能。	增加咪唑濃度或降低 pH 值進行洗脫。
	減少樣品量，或以線性咪唑梯度洗脱來降低蛋白濃度，而非咪唑步驟。嘗試使用去垢劑或改變 NaCl 濃度。	在洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂（例如、
	上載樣品到色譜柱或孔前先將其澄清。高含量的宿主蛋白和其他微粒可能會干擾目標蛋白的結合。考慮使用 HisTrap FF 粗柱或 HiTrap TALON 粗柱。	用更大容量的洗脱缓冲液和/或增加咪唑的浓度进行洗脱。
	组氨酸标记的蛋白质在上样/洗涤过程中被洗脱。	樣品和/或結合緩衝液中咪唑濃度過高。請注意，TALON Superflow 和 Ni Sepharose excel 的樣品和結合緩衝液中通常不需要咪唑。	在尿素或瓜-HCl 中對未折疊蛋白質進行純化，就像處理包涵體一樣，以調查組氨酸標籤是否被隱藏。為了減少樣本的稀釋，可以加入固態尿素或 Gua-HCl。考慮使用 His-10-tag 或在標籤與目標蛋白之間加入連結物以增加暴露。確保樣本中沒有濃度過高的螯合劑或強還原劑。增加洗滌和洗脫緩衝液的緩衝能力，避免咪唑造成pH值下降。	使用抗 His 抗体在 Western 印迹或提取物上检查构建体的序列。	降低流速或增加樣品在孔/批中的孵育時間，或使用較低的離心速度/真空度（SpinTrap 和 MultiTrap 色譜柱）。
		污染物可能對某些金屬離子具有高親和力、
		對於適用的格式（即預先包裝的 HisTrap 縱列），請將兩或三個縱列連接在一起，或更換為更大的縱列、
對於適用的格式（例如，預先包裝的 HisTrap columns），請將兩個或三個 columns 連在一起，或者換成更大的 columns。		聲波處理可能不夠。在聲波處理之前加入溶菌酶 (在 25 mM Tris-HCl, pH 8.0 中加入最多 0.1 容量的 10 mg/mL 溶菌酶溶液) 可能會改善結果。避免起泡和過熱，因為這可能會使目標蛋白質變性。
蛋白質在萃取過程中被吸附到細胞碎片上，並在凝集時流失。		改變萃取條件（pH、離子強度、嘗試洗滌劑溶解）。
蛋白質可能不溶（包涵體）。		蛋白質通常可以使用一般的變性劑，例如 4 至 6 M Gua-HCl、4 至 8 M 尿素或強去垢劑，從包涵體中溶解（並展開）。請參閱 洗出的蛋白質不純（SDS-PAGE 上有多條帶）。	蛋白酶已部分降解標記蛋白。
In vivo 蛋白質生物合成的異常，例如、過早終止翻譯。		改變發酵和誘導條件。考慮改變宿主菌株或宿主，以克服編碼偏差的問題。
污染物對金屬離子具有高親和力。		使用階梯式或線性咪唑梯度洗脫，洗脫前使用含有盡可能高濃度咪唑的結合緩衝液進行清洗，但不會造成標記蛋白的洗脫。可能需要第二層層析步驟，例如 SEC。
污染物與標記蛋白相關，例如、	在聲波處理細胞前加入去垢劑和/或還原劑。增加洗滌劑的濃度（例如：高達 2% 的吐溫 20），或在洗滌緩衝液中加入甘油（高達 20%），以破壞非特定的相互作用。增加咪唑濃度或改變純化所用的金屬離子。增加緩衝液中的氯化鈉濃度，最高可達 500 mM。
	在使用樣品後重複洗滌步驟，以獲得最佳收率和純度。
未澄清的裂解液可能會在純化過程中增加氣泡的形成。	在色谱系統中，在色譜柱和檢測器流動單元後附一個限流器可以防止這種情況發生。
多重捕集器：		在向孔中加入結合緩衝液之前，先加入 500 µL 去離子水兩次。