純化或移除具有外露胺基酸：His、Cys、Trp 和/或對金屬離子具有親和力的蛋白質和多肽

Chelating Sepharose High Performance, Chelating Sepharose Fast Flow, Capto Chelating

使用固定金屬離子誘導層析 (IMAC) 可以分離對金屬離子有誘導作用的蛋白質和肽。金屬透過螯合作用固定在色層介質上。某些氨基酸（例如組氨酸和半胱氨酸）會在中性 pH 值（pH 值為 6.0 到 8.0）附近與螯合金屬形成複合物，而蛋白質中的組氨酸含量是導致其與螯合金屬結合的主要原因。

IMAC 非常適合純化重組 (his)6 標記蛋白質 (請參閱手冊 Affinity Chromatography Vol. 2: Tagged Proteins, 18114275) 以及許多天然蛋白質。螯合 Sepharose 是用來 IMAC 純化暴露有 His、Cys 和 Trp 的蛋白質的介質，它是由金屬螯合形成配體（亞氨基二乙酸）與 Sepharose 結合而形成的。

在使用前，介質會載入二價金屬離子溶液，例如 Ni²⁺、Zn^2+_, Cu²⁺ 或 Co²⁺。與目標蛋白質的結合反應與 pH 值有關，降低 pH 值並增加緩衝液的離子強度，或在緩衝液中加入咪唑，即可洗脫結合的樣品。配體亞氨基二乙酸的結構如圖 1所示。

圖 1. 高效螯合 Sepharose 和快速螯合 Sepharose 的部分結構。

金屬蛋白通常不適合使用螯合層析法進行純化，因為它們傾向於清除色譜柱中的金屬離子。

表 1. 螯合 Sepharose 和 Capto 螯合層析介質的特性

	金屬離子容量	平均粒徑(μm)
螯合 Sepharose High Performance	氨基二乙酸通过醚键偶联到 Sepharose High Performance	23 µg/ml/td>	23微摩尔Cu2+/毫升	短期：2 to 14 長期：3 to 13	34
螯合Sepharose快速流	氨基二乙酸耦合到Sepharose 透過環氧樹脂耦合的間隔臂快速流動	22至30 µmol Zn2+/ml	短期：	22 至 30 µmol Zn2+/ml	短期：2 至 14 長期：3 至 13	90
Capto 螯合	二醋酸與 Capto 耦合。	22至33 µmol Cu2+/ml培養基	短期：2 至 14 長期：3 至 12	75

¹ 短期是指再生、原位清潔和消毒程序的 pH 間隔。長期指介質長期穩定而不會對其後續色譜性能造成不良影響的 pH 間隔。

 

萃取選項

1短期指再生、原位清潔和消毒程序的 pH 間隔。

表 2. 螯合 Sepharose 和 Capto Chelating 色層析介質包和預包柱的純化選項

	結合容量	注意事項
HiTrap® Chelating HP, 1 ml	12 mg/column	4毫升/分鐘	預先包裝1毫升色譜柱
HiTrap® 螯合 HP, 5 ml	60毫克/柱	20毫升/分	預先包裝5毫升色譜柱
螯合 Sepharose 快速流	12毫克/毫升介質	螯合 Sepharose 快速流	以懸浮液形式提供，可直接進行柱包裝
HiTrap Capto Chelating, 1 ml	30 mg 綠色螢光蛋白 (GFP)-his/column	3.8 ml/min	預製 1 ml 色譜柱
HiTrap® Capto Chelating, 5 ml	150 mg GFP-his/色譜柱	預製 5 ml 色譜柱
HiScreen Capto Chelating	130 mg GFP-his/column	4.6 ml/min	預製 4.7 ml 色譜柱。
Capto 螯合	30 mg GFP-his/ml 培養基	600cm/h	以懸浮液形式提供，可直接進行柱包裝。

¹ 請參閱附錄 4，將流速 (cm/h) 轉換為容積流速 (ml/min)。最大操作流速是在床高 10 cm、內孔距 5 cm 的填料柱中測量計算出來的。

選擇金屬離子

以下指南可用於初步實驗，以選擇對特定分離最有用的金屬離子：

• Cu²⁺提供強大的結合力，某些蛋白質只會與 Cu2+ 結合。在加料時，加載相當於填充柱容量 60% 的金屬離子溶液，以避免金屬離子在樣品應用過程中滲漏。或者，介質可以飽和，並在主柱後串聯一條短的 HiTrap^® Chelating HP 或填料式 Chelating Sepharose Fast Flow 的未充電副柱，以收集多餘的金屬離子。
• 鋅²⁺的結合力較弱，在許多情況下，可以利用這一點來實現蛋白質混合物的選擇性洗脫。裝入相當於填充柱容積 85% 的金屬離子溶液，為柱充電。
• Ni²⁺常用於他標蛋白。Ni²⁺ 溶液通常相當於色譜柱容積的一半就足以給色譜柱充電。
• Co²⁺和Ca²⁺也是替代品。

使用金屬離子為色譜柱充電，方法是讓適當的鹽溶液通過色譜柱，例如蒸餾水中的 ZnCl₂、NiSO₄或 CuSO₄。其他金屬可使用氯化物鹽。

有幾種方法可用來判斷色譜柱何時充電。如果在充電過程中使用蒸餾水中的金屬鹽溶液，洗出液最初的 pH 值較低，隨著介質中金屬離子的飽和，pH 值會回復到中性。用 Cu²⁺ 充電的進程很容易用肉眼跟蹤（色譜柱內容變成藍色）。用鋅離子給柱充電時，可使用碳酸鈉檢測洗出液中是否含有鋅。

結合緩衝液的選擇

中性或微鹼性 pH 會有利於結合。Tris-acetate (50 mM)、Sodium phosphate (20 至 50 mM) 和 Tris-HCl (20 至 50 mM) 是合適的緩衝液。

緩衝液中高濃度的鹽或去垢劑通常不會影響蛋白質的吸附，保持高離子強度（例如：500 mM 至 1 M NaCl）是良好的做法、

螯合劑如 EDTA 或柠檬酸盐不应加入，因为它们会从介质中剥离金属离子。

洗脱缓冲液的选择

使用对配体或目标分子有竞争作用的药剂梯度，可以获得结合物质的不同洗脱。可使用濃度增加的咪唑（0 至 500 mM）、氯化銨（0 至 150 mM），或對螯合金屬有抗性的物質，如組胺或甘氨酸。

由於 pH 值會影響結合部位帶電基團的電離程度，因此可使用梯度或逐步降低 pH 值來洗脫結合物。正常的 pH 值範圍為 7.0 至 4.0，大多數蛋白質的洗脫 pH 值介於 6.0 至 4.2 之間。

使用 EDTA (50 mM) 或其他強力螯合劑洗脫，會剝離金屬離子和其他結合物。此方法通常無法分辨不同的蛋白質。

如果使用了苛刻的洗脱条件，建议立即将洗脱后的馏分转移到较温和的条件下（或者将其收集到中和缓冲液中，或者直接转移到脱盐柱上进行缓冲液交换（参见缓冲液交换和脱盐，

）。a href="/TW/zh/technical-documents/protocol/protein-biology/protein-purification/sample-preparation1">附錄 1）。

在較低的 pH 值下，金屬離子的流失更為明顯。如果要純化相同的蛋白質，色譜柱不必在連續的純化之間進行剝離。

雖然金屬離子的滲漏非常低，但在蛋白質被洗脫之前，在第一根柱子之後串聯一根不帶電的 HiTrap^® Chelating HP 層析柱，可以避免在純化的產品中出現任何游離金屬。

進行分離

此方案可作為基礎，用於開發對金屬離子有親和力的蛋白質和多肽的純化方法：

• 金屬離子溶液：100 mM CuSO4
• 結合緩衝液：20 mM 磷酸鈉，500 mM NaCl，10 mM咪唑，pH 7.4
  
• 洗脫緩衝液：20 mM 磷酸鈉，500 mM NaCl，500 mM咪唑，pH 7.4
  
• 蛋白質和多肽與金屬離子的親和性開發純化方法。4
  

使用清水，而非緩衝液，洗去含有 20% 乙醇的色譜柱儲存液。這可避免下一步中鎳鹽沉澱的風險。

1. 用至少 2 CV 的蒸餾水清洗色譜柱。
2. 在色譜柱上加載 0.5 CV 的 100 mM 銅溶液。
3. 用 5 CV 蒸餾水清洗色譜柱。
4. 用 10 CV 結合緩衝液平衡色譜柱。
5. 以 1 至 4 ml/min（1 ml 色譜柱）或 5 ml/min（5 ml 色譜柱）的流速進樣。收集穿流部分。泵更適合應用於大於 15 ml 的樣品量。
6. 用 10 CV 的結合緩衝液清洗。
7. 使用 5 CV 洗脱緩衝液進行洗滌。
9. 用 10 CV 結合緩衝液清洗。此時，色譜柱已準備好進行新的純化，若要純化相同的 (his)6 標記蛋白，則很少需要重新載入金屬。

放大

）。a href="/TW/zh/technical-documents/protocol/protein-biology/protein-purification/column-packing-and-preparation-biomolecules">Appendix 3）。

清洗

• 用 5 CV 20 mM 磷酸钠、500 mM NaCl、50 mM EDTA、pH 7.4 溶液清洗去除金属离子
• 用 1 M NaOH 填充色谱柱并孵育 2 h，去除沉淀的蛋白质。用 5 CV 的水和 pH 7.0 的緩衝液洗去溶解的蛋白質，直到流出液的 pH 達到 7.0
• 或者用非離子洗滌劑（如 0.1% Tween 20）在 37 °C 下洗 1 分鐘。
• 用 70% 乙醇或 0%-30%-0% 異丙醇/水梯度清洗，去除脂質和非常疏水的蛋白質。

化學穩定性

在所有常用的水性緩衝液和變性劑（如 6 M 鹽酸胍、8 M 尿素和其他混沌劑）中都很穩定。

儲存

在中性pH值下，用20%乙醇清洗層析介質和色譜柱（填料介質使用約5 CV），並儲存於4 °C至8 °C。

長期儲存前，用 5 CV pH 7.4 的 20 mM 磷酸钠、500 mM NaCl、50 mM EDTA 洗去金屬離子。

長期儲存後，色譜柱必須重新充入金屬離子。