不同純化技術的原理與標準條件

 

親和層析 (AC)

親和層析介質根據蛋白質（或一組蛋白質）與附在層析基質上的特定配體之間的可逆相互作用來分離蛋白質。此技術非常適合用於擷取或作為中間純化步驟，只要有適當的配體可供所需蛋白質使用即可。AC 具有高選擇性及高容量。

目標蛋白被互補結合物（配體）特別地、可逆地結合。樣品在有利於與配體特異性結合的條件下使用。未結合的物質會被洗去，而結合的目標蛋白質則會透過改變條件以有利於洗脫的方式回收。使用競爭性配體進行特定洗脫，或透過改變 pH 值、離子強度或極性進行非特定洗脫。樣品在結合過程中會被濃縮，目標蛋白會以純化和濃縮的形式被收集。AC 分離的關鍵階段如圖 A11.1 所示。AC 也可用於去除特定的污染物；例如，Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub) 可去除絲氨酸蛋白酶。

圖 A11.1. 典型的親和淨化

Ion Exchange Chromatography (IEX)

IEX 媒介根據表面電荷的差異分離蛋白質，產生具有高樣品負載能力的高解析度分離。分離是基於帶電荷的蛋白質與帶相反電荷的層析介質之間的可逆相互作用。然後更改條件，使結合物質以不同方式洗脫。洗脫通常是透過增加鹽濃度或改變 pH 來進行。改變的方式可以是逐步的，也可以是連續的線性梯度。最常見的是使用鹽（NaCl）洗脫樣品，使用梯度洗脫（圖 A11.2）。目標蛋白在結合過程中被濃縮，並以純化、濃縮的形式收集。

圖 A11.2. 典型的 IEX 梯度洗脫。藍線 = 吸光度；紅線 = 電導率（鹽濃度）。

蛋白質的淨表面電荷會隨著周圍 pH 值的變化而變化。通常，當蛋白質高於其等電點（pI）時，會與負離子交換器（如 Q Sepharose）結合；當蛋白質低於其 pI 時，會與陽離子交換器（如 SP Sepharose）結合。然而，應該注意的是，結合取決於電荷，因此即使在 pI 的另一端，表面電荷也可能足以結合。IEX 通常用來結合目標分子，但如果需要，也可用來結合雜質。如圖 A11.3 所示，IEX 可以在不同的 pH 值下重複進行，以分離具有明顯不同電荷特性的多種蛋白質。

圖 A11.3. pH 對蛋白質洗脫模式的影響。V = 體積。

方法開發（按優先順序）

1. 使用 1 mL 小柱選擇最佳離子交換器，如 HiTrap^® IEX 選擇套件或 HiTrap^® Capto IEX 選擇套件，以節省時間和樣品。如果需要較長的填料床，請使用預填料的 HiScreen IEX 色譜柱。(HiTrap^® 色谱柱的床面高度为 2.5 cm，HiScreen 色谱柱的床面高度为 10 cm）。
2. 寻找最佳 pH 值，最大限度地提高容量和分辨率。如果已知目標蛋白質的等電點，從 0.5 到 1 個 pH 單位開始。此優化步驟可與優化樣品及結合緩衝液的離子強度結合。
3. 選擇最陡峭的梯度，以便在所選 pH 值下獲得可接受的解析度。
4. 選擇最高流速，以維持解析度並縮短分離時間。

為了減少分離時間和緩衝液消耗，請在方法優化後轉換為步進洗脫，如圖A11.4所示。

圖 A11.4. 步進洗脫。藍線 = 吸光度；紅線 = 電導率（鹽濃度）。

疏水相互作用層析 (HIC)

疏水相互作用介質分離疏水性不同的蛋白質。該技術非常適合純化方案中的捕獲或中間步驟。分離是基於蛋白質與層析介質疏水表面之間的可逆相互作用。高離子強度緩衝液可增強這種互動作用，這使得 HIC 成為 IEX 期間使用硫酸銨沉澱或高鹽分洗脫後的絕佳「下一步」。高離子強度溶液（如 1.5 M 硫酸銨）中的樣品在上柱時會結合。

洗脱通常通过降低盐浓度来进行（图 A11.5）。漸進式或連續遞減的鹽梯度進行改變。最常見的情況是，使用硫酸銨的遞減梯度洗脫樣品。目標蛋白在結合過程中會被濃縮，並以純化和濃縮的形式收集。其他洗脱程序包括降低洗脱液极性（乙二醇梯度可达 50%）、添加混沌物（尿素、Gua HCl）或去垢剂、改变 pH 值或温度。

圖 A11.5. 典型的 HIC 梯度洗脫。藍線 = 吸光度；紅線 = 電導率（鹽濃度）。

方法開發（按優先順序）

1. 蛋白質的疏水行為難以預測，必須仔細研究結合條件。使用HiTrap^® HIC選擇試劑盒或RESOURCE HIC測試試劑盒，選擇在所需鹽濃度範圍內具有最佳結合和洗脫效果的層析介質。對於疏水性未知的蛋白質，可從含有例如 1 M 至 1.5 M 硫酸銨的緩衝液開始。了解蛋白在結合緩衝液中的溶解度非常重要，因為高濃度的硫酸銨等可能會使蛋白沉澱。
2. 選擇可提供可接受解析度的梯度。
3. 選擇能提供可接受解析度的梯度，建議從 0 到 100% B 的 10 到 20 柱容量的線性梯度。
4. 如果樣品與介質強烈結合，pH、溫度、亂向離子或有機溶劑等分離條件可能會導致構象改變，因此應該改變。每種蛋白質的構象改變都是特定的。使用篩選程序來研究這些物質的影響。

為了減少分離時間和緩衝劑消耗，在方法優化後轉換為階段洗滌，如 圖 A11.6.

所示。

圖 A11.6. 步進洗脫。藍線 = 吸光度；紅線 = 電導率（鹽濃度）。

Size Exclusion Chromatography (SEC)

SEC 媒介可分離分子大小和形狀不同的蛋白質。當樣品容量減少時，此技術非常適合純化過程中的最終研磨步驟（樣品容量會明顯影響 SEC 的速度和解析度）。樣品採用等流洗離法（單一緩衝液，無梯度，圖 A11.7）。緩衝液條件可根據樣本類型或進一步純化、分析或儲存的需求而改變，因為緩衝液成分通常不會對解析度造成重大影響。蛋白質會在選定的緩衝液中以純化的形式收集。

圖 A11.7. 典型的 SEC 洗脫。

Reversed Phase Chromatography (RPC)

RPC 媒介根據蛋白質和肽與色層介質疏水表面的可逆性相互作用，分離具有不同疏水性的蛋白質和肽。蛋白質上載到色譜柱時會結合。然後，改變條件使結合物質以不同方式洗脫。由於反相基質的特性，結合通常非常強烈。使用有機溶劑和其他添加劑（離子配對劑）可調節結合。洗脫通常是透過增加有機溶劑濃度來進行，最常見的是乙腈。在結合與分離過程中濃縮的樣品會以純化、濃縮的形式收集。分離的關鍵階段如 圖 A11.8.

圖 A11.8. 典型的 RPC 梯度洗脫。藍線 = 吸光度；紅線 = % 緩衝洗提液。

RPC 常用於寡核苷酸和多肽的最終拋光，非常適合分析分離，例如多肽圖譜。

如果需要恢復活性和恢復正確的三級結構，通常不建議將其用於蛋白質純化，因為許多蛋白質在有機溶劑存在下會變性。

方法開發

1. 進行篩選，並根據結果選擇層析介質。
2. 選擇最佳梯度，以提供可接受的解析度。
3. 選擇最高流速，以維持解析度並縮短分離時間。
4. 若要進行大規模的純化，請轉換為梯級洗脫。
5. 轉換為疏水性較低的層析介質後，與層析介質強烈結合的蛋白質更容易被洗脫。