使用 HiTrap^® Protein G HP 色譜柱純化 IgG 抗體

HiTrap^® Protein G HP (圖 3.10)是一種方便的即用型色譜柱，預先包裝有Protein G Sepharose^® High Performance。該柱有 1 mL 和 5 mL 兩種規格。與所有 HiTrap^® 色譜柱一樣，HiTrap^® Protein G HP 可以用注射器、泵或色譜系統進行快速抗體純化。此外，透過串聯色谱柱，可大幅提升純化能力。

圖 3.10. HiTrap® Protein G HP 色譜柱專為使用注射器、泵或層析系統進行抗體純化而設計。

圖3.11.顯示小鼠單克隆IgG₁ 在HiTrap^® Protein G HP上的純化。單株抗體是從雜交瘤細胞培養上清液中純化出來的。

圖 3.11. (A) 用 HiTrap® Protein G HP 1 mL 柱從細胞培養上清中純化小鼠單克隆 IgG1。(B) 使用 PhastGel 10-15 (銀染色) 在 PhastSystem 上進行非還原 SDS-PAGE 分析，以及 (C) 瓊脂糖凝膠免疫擴散，證實小鼠 IgG1 的純度。

Sample Preparation

請參考第 2 章 (Desalting and buffer exchange) 的一般注意事項。

應根據結合緩衝液的成分調整樣品。要做到這一點，可以用結合緩衝液稀釋樣品，或使用 HiTrap^® Desalting、HiPrep 26/10 Desalting 或 PD-10 Desalting 柱進行緩衝液交換，第 2 章（Desalting 和緩衝液交換）。

樣品應完全溶解。我們建議在上柱前立即進行離心或過濾，以去除微粒物質 (0.45 µM 篩選器)。

切勿在色譜柱上使用混濁溶液。

緩衝液準備

結合緩衝液：0.02 M 磷酸鈉，pH 7.0

洗脱緩衝液：0.1 M 甘氨酸-HCl，pH 2.7

中和緩衝液：1 M Tris-HCl，pH 9.0

用於製備緩衝液的水和化學品應該是高純度的。使用緩衝液前，請通過 0.45 µM 篩檢器過濾。

若要使用注射器在 HiTrap^® Protein G HP 1 mL 或 5 mL 柱上進行純化，可使用 Ab Buffer Kit 隨附的結合緩衝液和洗脫緩衝液的 10× 儲存溶液製備緩衝液。

製備

1. 製備收集管，每毫升馏分加入 60 至 200 µL 1 M Tris-HCl，pH 9.0。

为了保持酸性亲和性 IgG 的活性，我们建议在收集管中加入 60 至 200 µL 1 M Tris-HCl pH 9.0，以確保樣品的最終 pH 值接近中性。

1. 在注射器或泵管中注入蒸餾水。取下瓶塞，將色谱柱與注射器（使用隨附的接頭）、實驗室泵或色譜系統 「滴對滴 」連接，以避免將空氣引入系統。
2. 移除色谱柱出口的卡扣端。
3. 用 3 至 5 柱体积的蒸馏水冲洗乙醇。
4. 用至少 5 柱体积的结合缓冲液平衡色谱柱。建議流速為 1 mL/min (1 mL 色譜柱) 和 5 mL/min (5 mL 色譜柱)*。
5. 使用與 Luer 接頭連接的注射器或泵將預處理的樣品注入色譜柱。
6. 使用結合緩衝液清洗（通常至少 5 至 10 柱容量），直到吸光度達到穩定基線或試劑中無物殘留。保持 1 至 2 mL/min（1 mL 柱）和 5 至 10 mL/min（5 mL 柱）的流速進行清洗。

* 使用 1 mL HiTrap^® 色谱柱的注射器时，1 mL/min 相当于约 30 滴/分钟；使用 5 mL HiTrap^® 色谱柱时，5 mL/min 相当于约 120 滴/分钟。

在接近生理 pH 值和離子強度的條件下，大多數物種和亞類的 IgG 都會與蛋白質 G 結合。有關特定物種 IgG 的最佳結合條件，請參閱最新文獻。

如果抗體與配體之間的相互作用很弱，則應避免過度清洗，因為這可能會降低產率。

8. 使用單步或線性梯度洗滌緩衝液進行洗滌。對於一步式洗脫，通常 5 個柱容量就足夠了。對於線性梯度洗脫，10 到 20 個柱容量通常就足夠了。保持 1 至 2 mL/min（1 mL 色譜柱）和 5 至 10 mL/min（5 mL 色譜柱）的流速進行洗脫。若要洗脫 IgG，必須視抗體而定，將 pH 值降低至 2.5 至 3.0 之間。
   9. 洗脱后，用 3 到 5 柱体积的结合缓冲液清洗柱子，再生柱子。

   使用脫鹽柱（Chapter 2, 脫鹽和緩衝液交換）脫鹽和/或將純化的IgG分離物轉移到合適的緩衝液中。

   要增加容量，可串联多支HiTrap^® Protein G HP色谱柱（1 mL或5 mL） 。HiTrap^® 柱可與注射器、蠕動泵或 液相層析系統連接使用（第5章ÄKTA層析系統的詳情）。

   HiTrap^® ProteinG Sepharose HP色谱柱的重复使用取决于样品的性质，只有在处理相同样品时才应考虑重复使用，以避免交叉污染。

   儲存

   儲存前，我們建議用5柱容量的20%乙醇清洗色譜柱，以防止微生物生長。將色谱柱儲存在 20% 的乙醇中，溫度為 2 °C 至 8 °C。