離子交換層析故障排除

圖 1. 理想的 IEX 分離：透過梯度洗脫，目標蛋白質得到良好分離

如果在這種良好解析的分離中，只有某些峰是值得關注的，那麼為了節省時間和緩衝劑，轉換到步進洗脫可能是有利的。本節其餘部分將集中討論可能導致非理想 IEX 分離的實際問題。

圖 2. 樣品在鹽梯度開始前洗脫

確保緩衝液在正確的容器中。透過脫鹽來降低樣品的離子強度，  第 156 頁，或使用起始緩衝液稀釋。對於陰離子交換器，增加緩衝液的 pH 值；對於陽離子交換器，降低緩衝液的 pH 值。如果蛋白在任何 pH 值下仍不結合，則可能是洗滌劑污染了色譜柱。

圖 3. 梯度開始時，樣品仍在洗脫

上樣後，UV痕跡必須在洗脫開始前回到基線，否則未與色譜柱結合的蛋白質會干擾分離。在開始梯度洗脫之前，增加起始緩衝液的容量（平衡步驟）。

圖 4. 樣品在高鹽洗過程中洗出

蛋白結合太強。確保緩衝液裝在正確的容器中。

相關蛋白在梯度後期洗脫

蛋白結合太強。增加梯度的離子強度。如果洗脱需要很高的盐浓度，最好改变 pH 值。對於陰離子交換器，降低緩衝pH值；對於陽離子交換器，提高緩衝pH值。表 6。

感兴趣的蛋白在梯度中过早洗脱：

蛋白结合力不强。檢查梯度的離子強度。改變 pH 值，對於陰離子交換器，增加緩衝 pH 值；對於陽離子交換器，降低緩衝 pH 值。表 6。

感兴趣的蛋白未得到充分解析

请参考本章内容，查看提高解析度的关键参数。也請參閱 表 6。

表 6. 疑難排解。

Situation<	原因	補救方法
減少或無流量流經列。	出口關閉或幫浦不工作。
	過濾器、端件、適配器或管路堵塞。
	脂蛋白或蛋白聚集沉澱。	在樣品製備過程中去除脂蛋白和聚集物，（附錄 1）。遵循清潔程序， Appendix 10。
	蛋白在色谱柱中沉澱。	在運行過程中修改緩衝液、pH 和/或鹽條件以保持穩定。遵循清洗程序， 附录 10。
	分离过程中去除稳定剂导致的色谱柱中的蛋白沉淀。
	色谱柱中出現微生物生長。	不使用時存放在有 20% 乙醇的環境中以防止微生物生長。經常過濾緩衝液。請遵循清潔程序，附錄 10。
所感興趣的峰與其他主要峰分辨不清。	檢查床面和頂部過濾器是否可能被污染。
	柱頂或柱後混合空間大。
	缓冲液pH值和/或离子强度不正确。	检查pH值和离子强度，确保色谱柱在上次运行后重新平衡。檢查所需的條件。
	次最佳洗脱条件，例如 pH 值不正确、梯度太陡、流速太高。	改變洗脫條件：改變 pH 值、使用較淺的梯度、降低流速（按優先順序列出）。
	樣品太黏稠。	使用緩衝液稀釋。將蛋白質濃度維持在 50 mg/mL 以下。
	色譜柱包裝不良。	檢查色柱效率 (Appendix 3)。如有需要，請重新包裝。使用預先包裝的色譜柱。
	色譜柱負荷過重。	減少樣品負荷。
	脂蛋白或蛋白聚集體沉澱。	在樣品製備過程中去除脂蛋白和聚集體（附錄 1）。
	色谱柱中的蛋白沉澱。	在運行過程中調整緩衝液、pH值和/或鹽的條件以保持穩定。
	色谱柱中出現微生物生長。	在有 20% 乙醇的情況下保存，以防止微生物生長。經常過濾緩衝液。按照清洗程序，附錄 10。
蛋白質未按預期結合或洗出。	蛋白質或脂質沉澱在色譜柱或色譜過濾器上。
	样品未正确过滤。	清洗色谱柱，过滤样品并重复。
	樣品在儲存過程中發生變化。
	蛋白在洗脱缓冲液中可能不稳定或失去活性。	確定蛋白質的pH值和鹽的穩定性。
	柱平衡未完成。	重複或延長平衡步驟，直到電導率和 pH 值恆定為止。
	蛋白正在形成聚集體並與介質強烈結合。
	樣品或緩衝液條件與之前的運行不同	檢查樣品和緩衝液條件。
	色谱柱中出現微生物生長。	不使用時存放在有20%乙醇的地方，以防止微生物生長。經常過濾緩衝液。請遵循清潔程序，附錄 10。
蛋白質洗脱比預期晚或根本沒有洗脫。
	離子強度太低。	增加洗脱缓冲液中的盐浓度。
	蛋白质和基质之间的离子相互作用。	保持緩衝液的離子強度高於 0.05 M.
	蛋白質與基質間的疏水作用。	降低鹽濃度以減少疏水作用。增加 pH 值。
蛋白洗脱时间比预期早（在洗涤阶段）。	降低樣品或緩衝液的離子強度。
	pH條件不正確。	增加pH（陰離子交換器）。降低 pH 值（陽離子交換器）。
	色譜柱平衡未完成。	重複或延長平衡步驟，直到電導率和 pH 值恆定為止
色譜圖中出現引導峰或非常圓渾的峰。	色谱柱中的通道。	使用更稀薄的介质浆重新填料色谱柱。检查色谱柱填料（附录 3）。
	色谱柱超负荷。	減少樣品負荷並重覆。
	色柱污染。	使用建議程序清洗。
峰值拖尾。	起始緩衝液條件不正確，樣品未與色譜柱結合。	調整pH值。
	樣品太黏稠。
	色谱柱填料太松。	检查色谱柱效率（附录 3）。使用更高的流速重新包裝。
峰值有前緣。	色譜柱填料壓縮。	檢查色譜柱效率（附錄 3）。使用較低的流速重新封裝。
洗脱液中出现介质/微珠。	柱填料压缩。	检查柱效率（附录 3）。使用較慢的流速重新包裝。
	底座支撑端件松动或断裂。
	色谱柱操作壓力過高。	請勿超過介質或色譜柱的建議操作壓力。
	在色谱柱包装过程中损坏了介质。	平衡松散介質時請勿使用磁力攪拌器
活性回收率低，但蛋白質回收率正常。	蛋白質在緩衝液中可能不穩定或失去活性。	確定蛋白質的 pH 值和鹽的穩定性。
	酵素與輔助因子或類似物質分離。	從分餾物中匯集等分並重覆檢測。
蛋白質產量低於預期。	蛋白可能已被蛋白酶降解。	在樣品和緩衝液中加入蛋白酶抑制劑，以防止蛋白酶消化。
	樣品製備過程中過濾器的吸附	使用其他類型的過濾器。
	樣品沉澱。	檢查 pH 值和鹽分條件，調整以提高樣品溶解度。
	疏水性蛋白質。	加入變性劑、極性降低劑或去垢劑。
	非特异性吸附。	降低鹽濃度以減少疏水作用。加入適當的洗滌劑或有機溶劑，例如 5% 異丙醇。
峰值太小。	樣品在選擇的波長下吸收很差。
	色譜步驟前後使用了不同的檢測條件。	所有檢測使用相同的檢測條件。
	過度帶寬。
比預期回收更多的樣品。檢查運行前後用於檢測的緩衝條件。
回收的活性比施加到色谱柱上的多。	色谱步骤前后使用了不同的检测条件。
	在分離過程中去除抑制劑。
背壓在一次運行中或連續運行中增加。檢查樣品準備。
	微生物生長。	在有20%乙醇的情況下保存，以防止微生物生長。經常過濾緩衝液。遵循清潔程序， 附錄 10.
	擾亂樣品。	改善樣品製備（附錄 1）。提高樣品溶解度：添加甜菜鹼（25 °C時最高10% w/v）、牛磺酸（25 °C時最高4% w/v，pH 8.5以下）或甘油（1-2 %）。對於疏水性樣品，可加入乙二醇、尿素、洗滌劑或有機溶劑。
	蛋白質在柱過濾器和/或床頂沉澱。如果可能，更換或清洗過濾器或使用新的色譜柱。
	pH值不正确导致沉淀。	校准pH计，配制新溶液，再试一次。改變 pH 值。
	離子強度增加時，脂蛋白會沉澱。
床層中的裂縫。	緩衝液未適當脫氣。	緩衝液徹底脫氣。
	色谱柱在低溫包裝或儲存，然後再加熱。	通過色譜柱將已脫氣的緩衝液排出小氣泡。如果緩衝液在冰箱或冷藏室儲存後使用，請特別小心。不要讓陽光或加熱系統使柱升溫。如有可能，請重新包裝色谱柱 (附錄 3)。
床面裂縫。	色柱中有大量漏氣。	檢查所有連接處是否漏氣。
在溶劑前端出現負峰。	折射率影響。	將樣品換入起始緩衝液。
色谱图中出现意外峰。	缓冲液杂质。	通过柱前运行缓冲液来清洁缓冲液。使用高品質試劑。
梯度上出現峰值。	前次樣品洗脫不完全	按照推薦的空白方法清洗色譜柱。
色谱图中出现尖峰。	UV监测器流动池中夹带气泡。	經常使用脫氣緩衝液。	鹽濃度改變時會形成膠束。	使用低於或高於臨界膠束濃度的任何洗滌劑，或改變梯度，使紫外線吸收的增加不會在樣品洗脫過程中發生。
	緩衝液雜質。	使用高品質的試劑。

* 極性有機溶劑，如甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈，濃度可在 0-20% 之間，但請記住，某些蛋白質在有機溶劑存在時可能會不可逆轉地失去其生物活性。
請注意，使用有機溶液時，背壓可能會增加。