YeastBuster™ 蛋白質萃取試劑，可快速、有效地從酵母中萃取蛋白質

酵母作為真核生物模型系統被廣泛研究。完整的基因組序列、表現文庫和缺失品系為基因篩選和選擇提供了必要的工具。¹ 酵母能夠對重組蛋白進行關鍵的轉譯後修飾，如糖基化、乙酰化、磷酸化、脂化、輔因子吸收，以及蛋白加工以去除前導序列和信號序列。cerevisiae、 Pichia pastoris、 Hansulae polymorpha和 Kluvyeromyces。/ 乳酸菌 經常被用來利用這些修飾來表達功能性蛋白質。³ 聚組氨酸（His-Tag^® 序列）融合技術已被用於酵母，以促進蛋白質的純化。^4,5 然而，酵母細胞的裂解是有問題的，因為它的細胞壁很厚，約佔細胞乾重的 25%。酵母細胞壁主要由多醣體和醣蛋白組成，其中碳水化合物的比例很高。典型的成分有 β-1,3- 和 β-1,6-D 葡聚糖、β-1,3- 和 β-1,4-D 葡聚糖、纖維素、甘露蛋白和甲殼素。這種聚合物和蛋白質的組合是由共價鍵、二硫化物鍵、氫鍵和疏水鍵的組合相互連結而成。⁶ 破壞酵母細胞的方法有很多，從使用β-1,3-葡聚糖酶進行酶解，到使用各種硬件進行機械破壞，壓力破壞、冷凍破裂和玻璃珠研磨劑結合機械和酶解方案。 S.cerevisiae 細胞裂解也是透過操作參與細胞壁生物生成的基因來控制的。⁷ 所有這些方法都會造成一定程度的破壞，但根據細胞類型和培養年限，有效破壞的程度是無法預測的，通常是透過試驗和錯誤來決定。

近來，透過專用試劑的開發，從原核生物和真核生物中萃取和回收蛋白質的過程已經簡化，不再需要嚴苛的機械破壞。BugBuster^® Protein Extraction Reagent,^8,9 or they can be extracted directly from the total culture without cell harvest, mechanical disruption, or extract clarification with ^8,9 
.a href="/TW/zh/technical-documents/technical-article/protein-biology/protein-purification/insect-popculture-reagent-method">PopCulture™ 蛋白質萃取試劑.^10,11 CytoBuster™ 和Insect PopCulture Reagents已經被開發出來，用於從培養的哺乳動物和昆蟲細胞中萃取蛋白質。在此，我們介紹 YeastBuster™ 蛋白質萃取試劑，這是一種特殊配方的混合物，由去垢劑、蛋白質穩定緩衝液和三(羥丙基)膦 (THP) 還原劑組成。這種強大的組合消除了繁瑣的機械和酵素裂解帶來的不一致，提供了一種快速、高效、溫和的提取方法，從酵母細胞中獲得可溶性活性蛋白。

與其他提取方法的比較

YeastBuster™ Reagent與其他兩種蛋白提取方法進行了比較：1) 另一種商用酵母蛋白提取試劑，以及 2) 傳統的玻璃珠法。用表達載體轉換的對數期 S. cerevisiae 細胞經離心收割後進行提取。用 SDS-PAGE、Non-Interfering Protein Assay^™ Kit 和酵素分析法分析這三種方法產生的提取物，以顯示並量化可溶性蛋白和酵素活性蛋白。

A.SDS PAGE

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Lane	樣品
M	完美蛋白™ 標記，10-225 kDa
1.	5 µL YeastBuster™ extract
2.	5 µL YeastBuster™ extract
3.	5 µL 競爭者試劑萃取液
4.	5 µL 競爭者試劑萃取液
5.	5 µL 玻璃珠萃取液
6.

B.蛋白質和報告器分析

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	YeastBuster™	競爭者	玻璃珠
蛋白質 (mg/mL)	6.1	3.2	0.65
GST (Δ A340/min)	0.071	0.023	0.007
β-Gal (Δ A570/min)	0.113	0.003	0.187

Figure 1.YeastBuster™ 蛋白提取試劑、另一種商業試劑和玻璃珠法的性能比較。

面板 A. 提取蛋白的 SDS-PAGE 分析（4-20% 梯度凝膠）和 Coomassie 藍染色。S. cerevisiae cells containing a recombinant plasmid expressing a 35.6 kDa GST-Tag™/His-Tag^® fusion protein were grown at 30°C, induced for expression, and harvested at OD₆₀₀ of 1.2.以 3,000 × g 離心收集細胞，並重懸於冰冷的無菌水中。將等量的細胞分佈到微離心管中，以 3,000 × g 離心。將細胞顆粒（約 65 mg 濕重）重懸於 330 µL 的各提取試劑中，並補充 0.5 mM AEBSF 和 15 µg/mL 苄脒。YeastBuster™ 試劑還包括 0.01 容積的 100X THP 溶液，如方案中所指示。用移液器初步重悬颗粒后，在室温下轻轻搅拌 YeastBuster™ Reagent 和竞争试剂样品 20 分钟。玻璃珠提取是通過將 65-mg 的沉澱物重懸在裂解緩衝液中完成的，該緩衝液含有 50 mM Tris-HCl、250 mM LiCl、100 mM (NH₄)₂SO₄、1.0 mM DTT 和 2% 甘油，加入約 50 µL 酸洗玻璃珠（直徑 100-150 µm），高轉速渦旋 4 分鐘，間歇性冰鎮。所有樣品在 SDS-PAGE 分析前以 16,000 × g 離心 5 分鐘。

面板 B. 分析總蛋白質和報告器活性。使用 Calbiochem's Non-Interfering Protein Assay™ Kit 測定三種方法提取的總蛋白。樣品為 10 µL YeastBuster™ 試劑提取物、10 µL 競爭者試劑提取物和 50 µL 玻璃珠提取物。根據試劑盒的規範，測試一式兩份。使用 GST-Tag 分析試劑盒測定 GST 活性。陰性對照物是帶有相同表達載體的 S. cerevisiae 宿主，但編碼的是 lacZ 基因而不是GST。β-gal活性使用表达 lacZ的宿主测定。使用 BetaRed™ β-Gal 分析試劑盒對提取物樣本（5 µL）進行一式兩份的檢測。陰性對照是來自 GST 表達宿主的萃取物。

SDS-PAGE分析（圖1A）顯示YeastBuster™ 試劑在相同分子質量範圍內具有優異的蛋白質提取效率。蛋白質分析數據（圖 1B）顯示 YeastBuster™ 試劑提取的蛋白質是競爭者酵母蛋白提取試劑的近兩倍，是玻璃珠法的近十倍。此外，還進行了報告實驗，測量提取物中重組谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和β-半乳糖苷酶（β-gal）的活性。GST 的活性數據顯示，YeastBuster™ 試劑提取物的活性比競爭試劑提取物高出近三倍，比用玻璃珠製備的提取物高出約十倍。酵母克星™ 試劑製備的表現重組 β-gal 的宿主提取物的活性比用競爭試劑製備的提取物高出 40 多倍。

由于YeastBuster™ 试剂或竞争试剂中的成分并不抑制β-gal的活性（数据未显示），因此像β-gal四聚体这样的超大型蛋白质（约465,000 Da）可能并不抑制β-gal的活性。465,000Da），由於物理性的夾持或與不溶性細胞成分的吸附性互動，不容易以化學方法從酵母細胞中萃取出來。玻璃珠可透過物理剪切細胞碎屑來促進 β-gal 的萃取，從而減少夾帶。較小的蛋白質如 GST 則較不容易受到這些互作作用的影響，因此較容易以化學方法萃取。YeastBuster™  試劑相較於玻璃珠及競爭者試劑所具有的快速、方便及生物相容性等優點，使其成為提取蛋白質最有吸引力的整體選擇。

GST的活性數據顯示，YeastBuster™試劑提取物的活性比競爭試劑提取物高出近三倍，比用玻璃珠製備的提取物高出約十倍。用 YeastBuster™ 試劑製備的表現重組 β-gal 的宿主提取物的活性酵素比用競爭試劑製備的提取物高出 40 倍以上。

YeastBuster™ 試劑提取物與 GST-Bind™ ；和Ni-NTA His-Bind^® 樹脂的相容性

YeastBuster™ 試劑提取的蛋白質用Ni-NTA His-Bind^® 固定金屬親和層析(IMAC)和GST-Bind™ 親和方法純化的相容性如圖2所示。從表達 GST-Tag™/ His-Tag^® 融合蛋白的對數期 S. cerevisiae 中製備可溶性提取物。提取物樣品經 GST-Bind™  及 Ni-NTA His-Bind^®  色層析。用 SDS-PAGE 分析純化的樣品清楚地證明 YeastBuster™ 與使用這兩種方法的高產量親和純化是相容的。雖然高濃度的 2-mercaptoethanol 或 dithiothreitol 通常用於酵母裂解緩衝液中，以減少細胞壁中的二硫鍵，但由於還原和濾取複合的 Ni²⁺，這些與 IMAC 不相容。還原劑 THP（隨 YeastBuster™ 試劑以獨立的 100X 儲存溶液提供）在濃度低到足以與 Ni-NTA His-Bind^® 色譜相容的情況下有效，同時能有效增強酵母細胞的裂解，即使在細胞壁厚度和芽疤使裂解變得越來越困難的固定相培養物中也是如此。不添加THP的YeastBuster™ 試劑可以裂解早期對數期收穫的S. cerevisiae ，但總蛋白提取效率會降低。

Lane	Sample
M	完美蛋白™ 標記，10-225 kDa
1.	2 µg GST-Bind™
2.	2 µg GST-Bind™
3.	2 µg Ni-NTA His-Bind® eluate
4.	2 µg Ni-NTA His-Bind®  洗提液
4.

圖 2. GST-Bind™ 和 Ni-NTA His-Bind^® 純化樣本的 SDS-PAGE 分析。

含有表達 30.5 kDa GST-Tag™/His-Tag^® 融合蛋白的重組質粒的 S. cerevisiae 細胞在 30 ℃下生長，誘導表達，並在 OD600 為 1.2 時收穫。培養物在 3000 × g 離心 10 分鐘以收集細胞。將沉澱物（2 g 濕重）用移液器輕輕移動並攪拌至 10 mL YeastBuster™ Reagent（含 0.01 vol 100X THP 溶液、125 U Benzonase^® Nuclease、0.5 mM AEBSF 和 15 µg/mL 苯甲脒）中重懸，然後輕輕攪拌 20 分鐘。樣品以 16,000 × g 離心 5 分鐘，然後將 4.5 mL 等分上清液應用於 1 mL 已平衡 GST-Bind™ 和 Ni-NTA His-Bind^® Resins 重力流柱上。用 10 mL 1X GST-Bind™ 洗滌緩衝液洗滌 GST-Bind™ 膠柱，再用 3 × 1 mL 1X GST-Bind™ 洗脱緩衝液洗脫。Ni-NTA His-Bind^® 柱用 5 mL 1X Ni-NTA Bind Buffer、15 mL 1X Ni-NTA Wash Buffer 洗滌，用 3 × 1 mL 1X Ni-NTA Elute Buffer 洗離。洗提液中的蛋白質含量由 BCA 和 Coomassie 分析法測定，重複樣本由 SDS-PAGE (4-20% 梯度膠) 和 Coomassie 藍染色法分析。Lanes are indicated.

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摘要

通過應用 YeastBuster™蛋白質提取試劑，可以快速、高效地從酵母細胞中提取和回收蛋白質，而無需將其暴露於與研磨、超聲波和壓力破壞相關的惡劣條件中。使用 YeastBuster™試劑可快速釋放可溶性活性蛋白質，並消除了繁瑣的機械和酶裂解造成的不一致性。除了粗提物中更高的總蛋白質產率和酶活性蛋白質的回收率外，還可以使用 GST-Bind^™ 和 Ni-NTA His-Bind^® resins 親和純化重組融合蛋白。

材料

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