磷酸酶抑制劑雞尾酒

Ian Gleiser, Pnina Yaish, Efrat Barnea-Gedalyahu, Dorit Zharhary

Introduction

磷酸化是一種可逆的蛋白質轉譯後修飾。蛋白激酶催化 ATP 帶負電的γ-磷酸基轉移至蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基側鏈，改變蛋白質的構象和活性。^1,23%到4%的哺乳動物蛋白質是激酶和磷酸酶， 有些對幾個目標蛋白質具有特異性，而有些則廣泛地作用於許多蛋白質。

蛋白磷酸化是控制蛋白活性、相互作用、定位和降解的關鍵調控機制。它控制信號轉導、細胞週期、凋亡、新陳代謝等過程。在典型的哺乳類動物細胞中，約有三分之一的蛋白質被磷酸化，其中許多蛋白質有多個磷酸化位點。絲氨酸磷酸化佔磷酸化蛋白體的 86%，而蘇氨酸和酪氨酸磷酸化則分別佔 12% 和 2%。^3-5

細胞利用蛋白質的磷酸化/去磷酸化作為控制機制有許多優點。

在研究涉及蛋白磷酸化的細胞過程（如信號傳遞級鏈和蛋白質-蛋白質互作），或分析蛋白質上的磷酸化位點和磷酸化蛋白純化時，必須使用磷酸酶抑制劑抑制細胞蛋白磷酸酶。這樣就可以在選定的時間點凍結目標蛋白/s 的磷酸化狀態。磷酸化資料庫 www.phosphosite.org 報告了 80,000 個磷酸化位點。

蛋白磷酸酶

蛋白磷酸酶根據其底物特異性被分為不同的子類別（表 1）。

1. 鹼性磷酸酶^6-8  - 一個非特異性磷酸酶家族，負責移除多種分子中的磷酸基團，包括蛋白質、核苷酸和生物鹼。哺乳動物的鹼性磷酸酶同工酶會受到高精氨酸和左旋咪唑類似物的抑制。然而，腸道和胎盤的同工酶不受左旋咪唑的抑制，但會受到咪唑的抑制。
2. 蛋白質 Serine/Threonine 磷酸酶^9,10 - 這類磷蛋白磷酸酶在體內佔 Ser/Thr 磷酸酶活性的大部分。它包括兩個主要的亞類：PP1 和 PP2。後者根據金屬離子的需求再進一步細分：PP2A 不需要金屬離子；PP2B 受鈣刺激；而 PP2C 則依賴 Mg²⁺ 。Ser/Thr 磷酸化酶會被許多來自海洋海綿、土壤鏈黴菌和其他微生物的小分子所抑制。最著名的有 okadaic acid、calyculin A、microcystin-LR、tautomycin、fostriecin 和 cantharidin。這些化合物的活性對各種 Ser/Thr 磷酸化酶有不同的特異性。¹¹
3. 蛋白質酪氨酸磷酸化酶¹² - 一組利用胱氨酰磷酸化酶中間體來移除蛋白質上磷酸化酪氨酸殘基上磷酸基的酵素。這些酵素是訊號傳導通路中的關鍵調控元件。酪氨酸磷酸酶會被正戊二烯酸鹽和相關化合物以及氟化鈉所抑制。
4. 雙特异性（Tyr 和 Ser/Thr）磷酸酶³ - 雙特异性磷酸酶是蛋白質酪氨酸磷酸酶的一個亞類，它們也能同時使絲氨酸和蘇氨酸殘基去磷酸化。它們參與調控關鍵的細胞訊號傳導通路。這些抑制劑的具體例子可參考¹³

。

表一動物組織和細胞培養物中存在的磷酸酶類型。參考文獻：(14,15,16,17,18,19)

磷酸酶	pHspectrum	抑制劑
鹼性磷酸酶	8-11	溴代四咪唑14levamisole,钒酸鹽1516
Ser/Thr磷酸酶9-10（即。e.,PP28 和 PP2C)	7-8	Okadaic acid17 Micro-Cystin LR Cantharidin, lnhibitor-2<
Ser/Thr磷酸酶9-10 - 離子依賴型（i.e.,		7-8	EDTA,Okadaic acid,cyclosporinF,K-50618
酪氨酸雙特异性12	7-8	釩酸鹽18過氧釩酸鎓化合物19
雙特異性磷酸酶		釩18

磷酸酶抑制劑雞尾酒

磷酸酶抑制劑的使用對於所有類型的磷酸化研究都至關重要。我們提供一系列磷酸酶抑制劑雞尾酒，涵蓋最廣泛的磷酸酶，以確保蛋白質免受去磷酸化。該系列包含 2 種雞尾酒：磷酸酶抑制劑雞尾酒 2 (Cat.No. P5726）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒 3（Cat.No. P0044）。磷酸酶抑制劑雞尾酒 3 是我們最新的磷酸酶抑制劑雞尾酒，是針對 Ser/Thr 磷酸酶的磷酸酶抑制劑混合物。磷酸酶抑制劑雞尾酒 3 取代磷酸酶抑制劑雞尾酒 1 (Cat.No. P2850）。兩種雞尾酒的差別在於新的磷酸酶抑制劑雞尾酒 3 含有萼萼甲，而非磷酸酶抑制劑雞尾酒 1 中的微囊藻毒素-LR。

表二磷酸酶抑制劑雞尾酒成分

Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 Cat No.P2850	磷酸酶抑制劑雞尾酒 2 Cat.No. P5726	磷酸酶抑制劑雞尾酒 3 No.P0044
Cantharidin (-)-p-8romotetram lsole Microcystin LR	Sodium orthovanadate Sodiumm olybdate Sodium tartrate lmidazole	Cantharidni (-)-p-Bromotetram isole Calyculin A

實驗結果

以下實驗數據比較了新型磷酸酶抑制劑雞尾酒3和其取代的磷酸酶抑制劑雞尾酒1（Cat.No. P2850）的抑制效果。

值得一提的是，為了抑制多種磷酸酶並有效降低磷酸酶的總活性，建議同時使用我們的磷酸酶抑制劑雞尾酒 2 (Cat.Cat.No. P5726）和Phosphatase Inhibitor Cocktail 3（Cat.No. P0044）。

使用放射性底物32P-Ser磷酸化酶A在pH 7.5、30 °C条件下测定各种细胞和组织提取物中的内源性PP1α样活性。磷酸酶抑制劑 Cocktail 1 (Cat. No. P2850)或磷酸酶抑制劑 Cocktail 3 (Cat. No. P0044)以1%的最終濃度加入到提取物中，30 °C，5分鐘後進行PP1α-like活性測定。在 圖 1 中顯示的活性是相對的，而不是絕對的。剩餘的活性越小，表示被放置在反應中的雞尾酒抑制的程度越大。

* 這些樣品觀察到的值太低，無法在圖中看到，非常接近零。

圖 1. 抑制細胞和組織萃取物中的 PP1α 類活性

蛋白磷酸酶 1α 類活性的抑制

Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (Cat.No. P0044）是細胞和組織中蛋白磷酸酶 1α-like 活性的有效抑制劑。以下實驗證明其抑制效率，並與之前的磷酸酶抑制劑 Cocktail 1 (Cat.No. P2850）。

人胎盘每毫克蛋白显示的 PP1α 样活性比其他组织提取物高 10-20 倍。

人胎盘每毫克蛋白中的PP1α样活性比其他组织提取物高10-20倍，因此，我们选择它来证明磷酸酶抑制剂鸡尾酒的抑制效率。

在pH7.5，30 °C条件下，使用放射性底物 P-Ser磷酸化酶A测量人胎盘提取物中的内源性PP1α样活性。No. P2850）或磷酸酶抑制劑雞尾酒 3（Cat.No. P0044) were added to the extract at 30 °C, 5 minutes prior to assaying PP1α-like activity.

牛肝提取物中的內源 AP 類活性是在 pH 10.4、37 °C 下以 pNPP 為底物進行比色法測定的。將提取物與磷酸酶抑制劑雞尾酒 3 (Cat.No. P0044）單獨或與磷酸酶抑制劑雞尾酒 2（Cat.No. P5726），37 °C，3 分鐘。

鹼性磷酸酶 (AP) 類活性的抑制

如上所述，不同的鹼性磷酸酶同工酶會受到不同抑制劑的抑制。磷酸酶抑制劑雞尾酒 3 (Cat.No. P0044）可強力抑制牛肝提取物中的鹼性磷酸酶 L-同工酶，與磷酸酶抑制劑雞尾酒 2（Cat.No. P5726)(圖 3A）。

磷酸酶抑制劑雞尾酒 3（Cat.No. P0044）對鹼性磷酸酶活性的P-異構體的抑制作用很小，而P-異構體在人類胎盤萃取物中含量豐富，因此使用磷酸酶抑制劑雞尾酒2（Cat.No. P5726 (Figure 3B).

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圖 3A & B. 劑量依賴性抑制牛肝萃取物中的鹼性磷酸酶 (AP) 類活性

材料

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