降雨程序

蛋白沉澱是二維電泳的樣品製備中的一個可選步驟。沉澱後在樣品溶液中重懸浮，通常用於選擇性地將樣品中的蛋白質與污染物質（如鹽、去垢劑、核酸、脂質等）分離，否則這些物質會干擾 2-D 結果。沉澱後再重新懸浮也可用於從稀釋的來源（如植物組織、尿液）製備濃縮的蛋白質樣品。但請注意，沒有一種沉澱技術是完全有效的，有些蛋白質在沉澱後可能不容易再上浮。因此，在樣品製備過程中採用沉澱步驟會改變樣品的蛋白質狀況。

Cytiva的2-D Clean-Up Kit可用於去除污染物質和改善2-D電泳圖譜。蛋白質用沉澱試劑組合沉澱，而干擾物質，如核酸、鹽、脂質或去垢劑，則留在溶液中。樣品可重新懸浮於所需的變性溶液中進行 IEF。每個試劑盒可處理 50 個樣本，每個樣本最多 100 µL。第 1.4.1 節（使用 2-D Clean-Up Kit 來清理樣品）描述了該試劑盒，並提供了使用規程。

表 8 列出了一些可以使用的沉澱技術。如果樣品製備需要沉澱，通常只使用一種沉澱技術。

表 8.降水程序。

沉淀法	一般程序	限制条件
硫酸銨沉澱 (「鹽析」) 在高濃度鹽的存在下，蛋白質容易聚集並從溶液中沉澱出來。	製備蛋白質，使蛋白質溶液的最終濃度為 > 1 mg/mL，緩衝溶液為 > 50 mM，含有 EDTA。緩慢加入硫酸銨至所需的飽和百分比 (44)，攪拌 10-30 分鐘。	許多蛋白質在高鹽濃度下仍可溶解，因此當需要總蛋白質的代表性時，不建議使用此方法。 不過，此方法可用於預抽提或濃縮。殘留的硫酸銨會干擾 IEF，必須移除（45）。 請參閱第 1.5 移除鹽分 (Desalting samples using Mini Dialysis Kit)。
TCA 沉澱 TCA（三氯乙酸）是非常有效的蛋白質沉澱劑。	將 TCA 加入萃取物至 10-20% 的最終濃度，然後讓蛋白質在冰上沉澱 30 分鐘 (46)。 此方法可限制蛋白水解及其他蛋白修飾。 離心並用丙酮或乙醇洗滌膠粒，以去除殘留的 TCA。	蛋白質可能難以溶解，也可能無法完全溶解。
Proteins may be difficult to resolubilize and may not resolubilize completely.
丙酮沉澱 此有機溶劑常用於沉澱蛋白質。	在提取液中加入至少三体积的冰冷丙酮。讓蛋白質在 -20 ºC 下沉澱至少 2 小時。	不完全回收所有蛋白。 丙酮與試管的相容性可能是個問題。
使用 TCA 在丙酮中沉澱 TCA 和丙酮的組合常用於在 2-D 電泳的樣品製備過程中沉澱蛋白質，比單獨使用 TCA 或丙酮更有效。	將裂解或破壞的樣品懸浮在10% TCA 與 0.07% 2-mercaptoethanol 或 20 mM DTT 的丙酮中。離心沉澱蛋白質，並用含有 0.07% 2-mercaptoethanol 或 20 mM DTT 的冷丙酮清洗沉澱物。透過風乾或凍乾去除殘留丙酮 (5, 28, 34, 43, 51, 52)。	蛋白質可能難以溶解，也可能無法完全溶解。
酚萃取後使用甲醇中的乙酸銨沉澱 此技術已被證實對於含有高含量干擾物質的植物樣本非常有用。	將樣本中的蛋白質萃取到水或緩衝液飽和的苯酚中。 用甲醇中的 0.1 M 醋酸銨將蛋白質從苯酚相中沉澱出來。 殘餘丙酮蒸發 (42, 43, 47, 53)。	此方法複雜且費時

材料

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