Ni-NTA-Atto 結合物可靈敏、特異地檢測聚組苷標記蛋白質
最先進的重組蛋白質應用需要可靠的檢測方法。聚組苷是加入重組蛋白中最常用的親和標籤之一。它可以插入 N 端或 C 端，並在各種宿主中表達。由於其尺寸小，聚組氨酸標籤是蛋白質純化和檢測的優秀工具。在 Western 印迹上免疫检测 His 标记的融合蛋白通常使用多聚组氨酸抗体，然后使用与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等酶结合的第二抗体。
Ni-NTA-Atto結合物可對His標記融合蛋白進行特異性和高靈敏度的檢測。Ni-NTA-Atto複合物（Nα,Nα-雙(羧甲基)-L-賴氨酸，鎳(II)複合物，與Atto染料結合）對聚組苷標籤具有特異性，交叉反應極少。Atto 染料可在常見的波長下發出強烈的螢光信號，且淬滅極少。1,2 Ni-NTA-Atto 結合物可直接應用於 SDS-PAGE 凝膠或 Western 印迹膜上進行螢光成像，並已成功應用於活細胞中。1,2 與蛋白質-抗體結合相比，使用 Ni-NTA-Atto 結合物進行檢測所需的孵育時間較短。由於 Ni-NTA 複合物直接與螢光體結合，因此不需要二次反應。因此，與傳統的免疫檢測方法相比，其程序更快、更靈活（圖 1）。
圖 1.傳統抗體化學發光免疫檢測（左）與 Ni-NTA-Atto 結合物檢測（右）的蛋白質檢測比較。免疫檢測是在 Western 印迹後的轉移膜上進行，而 Ni-NTA-Atto 結合物則可在轉移膜上使用，或在固定後直接在 SDS-PAGE 凝膠上使用。
在SDS-PAGE凝膠上直接檢測組氨酸標記蛋白質
直接將Ni-NTA-Atto結合物應用於SDS-PAGE凝膠，可在不同時間點快速、簡便地檢測監測蛋白質純化或蛋白質表達。使用螢光成像觀察到 His-tagged p38 MAPK 的檢測限為 50 ng（圖 2）。
圖 2.His-tagged p38 MAPK 蛋白 (500 ng - 25 ng) 在 4-20% Tris-Glycine SDS-PAGE 凝膠上分離。凝膠在 40% 的乙醇/10% 的乙酸中固定過夜，用水洗淨，並在黑暗中與 Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) 共孵育。凝膠洗淨後，使用 FLA-3000 Fuji® 雷射掃描器，搭配 633 奈米激發及 675 奈米發射濾光片進行成像。Ni-NTA-Atto 647N (λex 647 nm, λem 669 nm) 在光譜的紅色區域被激發。
Western 印迹转移后组氨酸标记蛋白质的检测
电泳后，可将蛋白质从 SDS-PAGE 凝胶转移到低荧光 PVDF 膜上，这种膜更耐处理。傳統的 Western 印跡對於多組氨酸標籤效果很好，但是很花時間。
將 Ni-NTA-Atto 結合物應用於膜上，可獲得與直接凝膠檢測相媲美的靈敏度。乾燥膜可增強信號強度（圖 3）。此外，Ni-NTA-Atto 結合物可在 20 mM EDTA 中孵育 60-90 分鐘，從使用過的膜上剝離。
圖 3.His-tagged p38 MAPK 蛋白 (500 ng - 25 ng) 經 4-20% SDS-PAGE 凝膠分離。將蛋白質轉移至低螢光 PVDF 膜上，以 PBS 中的 5% BSA 阻斷過夜，再以 PBS-T 沖洗，並在黑暗中與 Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) 共孵育。膜洗淨後使用 FLA-3000 Fuji 雷射掃描器以 633 奈米的激發和 675 奈米的發射濾光片成像。
傳統 Western 免疫印跡與 Ni-NTA-Atto 結合物的程序比較如 表 1所示。直接 SDS-PAGE 凝膠檢測是最方便的，因為它省略了轉移步驟。與 SDS-PAGE 凝膠相比，使用 Ni-NTA-Atto 結合物進行 Western 印迹膜的檢測限與 SDS-PAGE 凝膠相似，但沒有凝膠損壞的風險。無論在哪一種情況下，操作時間都比傳統抗體技術要短。
表 1.傳統 Western 免疫印跡、使用 Ni-NTA-Atto 結合物進行 Western 印跡，以及使用 Ni-NTA-Atto 結合物在 SDS-PAGE 凝膠上直接檢測的方案比較。將 250 μg 溶於 250 μL PBS 中，製備 Ni-NTA-Atto 原液。
Ni-NTA-Atto結合物為特異、靈敏地檢測His標記融合蛋白提供了傳統抗體免疫檢測的重要替代方法。使用 Ni-NTA-Atto 可縮短實驗時間，省去耗時的抗體驗證實驗，節省時間和費用。
參考資料
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