流式細胞儀故障排除指南：如何改善流式細胞儀分析

流式細胞計學根據物理和螢光特性來表征和/或分類異質懸浮細胞群。要獲得最佳結果和資料分析，必須對螢光劑及其特性、光譜重疊和溢出、補償和擴散，以及可能影響測量靈敏度的流式細胞儀變數有基本瞭解。

以下流式細胞儀疑難排解指南說明了在流式細胞儀實驗中遇到的最常見問題的可能原因和解決方法。點選下列常見問題，即可獲得如何改善您的流式細胞計量分析的提示，這些提示以簡單易用的表格整理。

• 信號喪失或缺乏<
• 每天結果的差異性
• High Fluorescent Intensity
• Suboptimal Cell Scatter Properties
• 抗體在其他應用中有效，但在流式細胞計量中無效

我們致力於為全球的研究人員提供最佳的解決方案和服務。本流式細胞計數故障排除指南涵蓋最常遇到的問題。然而，有些問題可能與個人的特定實驗有關。請聯繫我們的技術服務團隊，以瞭解您在使用我們的抗體進行流式細胞計量應用時可能遇到的任何具體問題。 

請閱讀 How to Select Flow Cytometry Dyes for more tips to enhance your flow cytometry experiments.

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獲取率大幅降低

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原因	建議解決方案
儀器上的流體通路阻塞	將樣品稀釋至約 0.5 百萬個細胞/毫升。 经过多次使用后，任何标准流式细胞仪的流体系统都可能需要清洁。在檢測期間或之後，執行標準清潔程序來清潔流體系統。
細胞結塊	黏附或粘稠的細胞會導致細胞結塊。 另外，使用細胞過濾器來消除細胞團塊。

遺失或缺乏訊號 

Cause	Suggested Solution
樣品中細胞數量不足	在分析過程中的洗滌步驟中，細胞丟失很常見。在分析過程中，確保細胞密度維持在約每毫升 0.5 百萬個細胞。
靶标在细胞内	使用适当的渗透协议确保细胞内染色。 某些細胞固定劑可能會影響某些表面表位的檢測。因此，最好在染色前測試固定劑的效果。
Target protein is not expressed	檢視文獻，確認所要測試的蛋白質在細胞中有表達。  確保您的樣本含有表達足量目標蛋白質的細胞。 當目標蛋白的表達濃度低或表達頻率低時，最好加入共染色來區分低表達的目標蛋白或低頻率的細胞群。
結合試劑盒失敗	嘗試使用預結合的一抗。 使用不同的抗體測試結合試劑盒。
在多色實驗中，染料亮度和抗原表達並不是最佳匹配&&。nbsp;	檢視文獻，檢查特定細胞類型的抗原表達水平。 使用低表達抗原的明亮染料。 請參閱多色流式細胞計法 以獲得更多提示。
细胞可能需要刺激才能表达目标蛋白	某些目标蛋白可能只有在适当的刺激剂刺激后才能表达。嘗試不同的刺激劑、濃度和/或處理時間，以最佳化目標蛋白的表達。
抗原-抗體結合可能不理想	檢查抗體的物種特異性。 優化 抗體培養時間與溫度。
抗體已降解	確保抗體儲存於建議溫度。 嘗試新一批抗體。
一抗和二抗不相容	使用好的二抗可以顯著改善結果，消除或減少假陽性或陰性染色。 使用與一抗類別和/或亞類相匹配的二抗。 使用針對一抗培養的物種培養的二抗。 請參閱如何選擇第二抗體 以獲得更多提示。
样品中死细胞太多	抗体容易粘附在死细胞上，这可能导致 假阳性。最好使用活力染料來評估細胞的健康狀況。 嘗試製備新鮮的細胞。
抗体不足	缺乏信号可能表明在染色过程中需要使用过量的抗体。對於某些細胞類型，可能需要進一步滴定抗體，以獲得理想的染色濃度。

高背景和/或非特異性細胞染色

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原因	建議的解決方案
非特異性染色和背景可能表示在染色過程中需要使用較少的抗體。對於某些細胞類型，可能需要進一步滴定抗體，以獲得理想的染色濃度。
实验中二抗和一抗的交叉反应	选择能与一抗特异性结合的二抗。 使用預先結合的一抗。
針對非特異細胞	an appropriate isotype control and subtractract any Fc binding signal. 如果需要，包括二抗結合物對照。 選擇不顯示交叉反應的二抗。 染色前用適當的 Fc 阻斷劑預孵育細胞以減少細胞的非特異結合。 染色時在 PBS 中加入 1-5% BSA，以減少細胞的非特異結合。
過多的第二抗體	如果使用第二抗體，嘗試進一步減少第二抗體的用量。

每天結果的變異性

Cause	Suggested Solution
細胞活力的變化	監測實驗細胞培養物，以確保分析中的細胞活力和細胞數量一致。
儀器校正變更	每天或每週對儀器進行品質檢查（例如：校正）、
使用不同批次的抗體	每套實驗使用一批抗體。 使用預先結合的一抗。

高螢光強度

原因	建議解決方案
抗體濃度過高	減少加入每個樣品的抗體量。
過量抗體誘捕
過多的第二抗體	如果使用第二抗體，嘗試進一步減少第二抗體的用量。 嘗試預先結合的一抗。 使用供應商驗證的試劑來限制二抗的擴大效果。

次優化細胞散佈屬性

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Cause	Suggested Solution
儀器設定不正確	確定已載入正確的儀器設定。
固定或通透不良的細胞	確保載入正確的儀器設定。	遵循標準的固定和通透方案。 避免將細胞快速浸入低張性溶液或甲醇而損傷細胞。

抗體在其他應用中有效，但在流式細胞計中無效

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原因	建議解決方案
使用已測試且建議用於流式細胞計應用的抗體。 請透過網站 here.

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