樣品準備

Standardization &; Calibration

色譜法

Measurement & Analysis

本報告介紹了反相 HPLC-ELSD（高效液相色譜-蒸發光散射檢測）應用於 Erbitux^® 抗體藥物配方（Erbitux^®是使用單克隆抗體西妥昔單抗的藥物配方的商品名）中聚山梨醇酯 80 的定量分析。使用固相萃取法進行樣品製備，並製備一組七種校正溶液進行系統校正。

實驗程序

收到的樣品為 Erbitux^® 藥物製品（DP，5 mg/mL cetuximab 的製劑，輔料：氯化鈉、甘氨酸、聚山梨醇酯 80、一水檸檬酸、氫氧化鈉、水），並儲存於 8 °C。在製備樣品前，先將樣品加熱至室溫。本工作分析了一套兩批的 Erbitux^® DP。樣品的聚山梨醇酯 80 濃度約為 0.1 mg/mL。上載到固相萃取 (SPE) 試劑盒之前不需要稀釋。

樣品製備

空白樣品以純水為代表，不進行固相萃取處理。Erbitux^® DP 樣品經由 SPE 純化。詳細的樣品製備過程如下：

1. 4M 胍基鹽酸溶液
   用 40 mL 水稀釋 80 mL 胍基鹽酸溶液 6M。
2. 10%甲醇
   用90 mL水稀釋10 mL甲醇，得到10%甲醇水溶液。
3. 樣品準備 - 固相萃取
   1. 將 Supel^™ Swift HLB SPE 管芯置於 Visiprep^™ SPE 真空歧管中。
   2. 使用 1 mL 甲醇進行預洗。
   3. 用 1 mL 水調理。
   4. 加入 0.5 mL Erbitux^® DP 樣品溶液，再加入 0.5 mL 水。
   5. 用 1 mL 4M 胍盐酸盐溶液清洗。
   6. 用 1 mL 10% 甲醇清洗。
   7. 用 1 mL 乙腈洗滌，在 15 mL 離心管中收集洗出液。
   8. 重複洗滌一次，在同一離心管中收集洗出液。
   9. 用 250 µL 水重新取代樣品，渦旋混勻後轉移到 HPLC 玻璃瓶中。

標準品的製備

校正標準品的製備方法如下：

1. PS 80 標準儲備溶液 1.2 mg/mL
   配製 PS 80 儲備溶液 (c = 1.2 mg/mL)時，稱取約 60 mg PS 80 至 50 mL 容量瓶中，加水至刻度。
2. PS 80 校正標準液
   根據表 1 製備稀釋系列，以獲得一套七個校正標準液。

RP-HPLC-ELSD 系統設定

以下表 2和3列出了日立 Chromaster 色譜系統的基本設定和用於分析聚山梨醇酯 80 的梯度條件。

DATA ANALYSIS

使用 Chromeleon^™ 7.2.10 軟體處理資料；由於應用梯度譜，且必須總結大約 6 至 9 分鐘保留時間範圍內的峰區，因此以手動方式執行整合。超出上述範圍的峰值積分會被自動禁止。應用的校正類型為 "Quad with offset"。

校正資料

共製備了七個聚山梨醇酯 80 校正標準。二次迴歸顯示所得的校正曲線在整個校正範圍內的擬合效果極佳，R2 值為 0.9997（見圖 2）。從校正實驗中獲得的實驗數據列於表 4 中。圖 3 顯示分析七個校準標準品後所得到的色譜圖的重疊圖。

RESULTS

本研究使用 Ascentis^® Express C18 HPLC 色譜柱，對 Erbitux^® 抗體藥物配方的兩個不同批次中的聚山梨醇酯 80 進行 HPLC-ELSD 分析。所應用的 HPLC 色譜柱由反相改性、表面多孔的矽膠顆粒組成，可進行快速、高效能的分析。以親水-親油平衡固相萃取法製備樣品，可有效地將 PS 80 與主要的藥品輔料分離。分析了 B4G 和 BM9 批次各五份樣品的複本，以確定其聚山梨醇酯 80 的含量（另見 表 5）。
分析結果顯示，樣品中的聚山梨醇酯 80 含量分別為 0.12 和 0.14 mg/mL，與抗體藥物配方中典型的表面活性劑濃度相符。在整個校正範圍內，校正曲線呈現良好的二次方擬合，R2值為0.9997，HPLC-ELSD方法的LOD為0.0055 mg/mL。

結論

本報告介紹了使用反相 HPLC-ELSD 分析定量分析兩種 Erbitux^® 抗體藥物配方中聚山梨醇酯 80 的整個工作流程。應用Ascentis^® Express C18 HPLC色譜柱，以超微孔矽膠顆粒填料分離聚山梨醇酯80和基質化合物。

工作流程包括使用HLB濾盒進行固相萃取的樣品淨化過程，以及隨後使用反相HPLC-ELSD分析樣品。

建立的色譜方法適用於 PS 80 的樣品分離和分析，也可應用於類似非離子表面活性剂的定量分析。