Procainamide 標記單株抗體糖組分析的分步規程

Romana Rigger, PhD, Pegah Jalili, Uma Sreenivasan, PhD, Kevin Ray, PhD

Merck

釋放 N-糖分析的工作流程

本研究開發了一套以 UHPLC-FLR-MS 為基礎的完整工作流程，用以分析 N-glycan profile。該工作流程提供以下內容：

• 樣品準備和分析的分步說明
• 增加檢測靈敏度的普羅卡因酰胺標籤

單株抗體的特性分析--利用 UHPLC-FLR-MS 和 Procainamide 標籤分析阿達木單抗的 N 連糖基化

對治療用 mAbs 進行謹慎而徹底的特性分析對於確保藥物的安全性和有效性至關重要。 因此，為每種治療性蛋白質建立幾個關鍵品質屬性 (CQA)，並證明生產批次在可接受的範圍內，對於創新藥和生物仿製藥來說都是必要的。

單株抗體 (mAbs) 具有靶點特異性，療效高且副作用少。糖基化是 mAbs 最常見也是最重要的轉譯後修飾之一。附著在抗體上的聚糖對治療用阿達木單抗的藥代动力学、藥效和安全性扮演重要角色。糖基化涉及在蛋白質的特定位點上附著聚糖，最常見的是在天冬酰胺（Asn，N-鏈接）或絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr，O-鏈接）氨基酸殘基上。糖基化有兩種類型；N-連結的糖基化和 O-連結的糖基化，這兩種類型對於蛋白質的構象、蛋白質的活性、提供蛋白質分解降解的保護，以及細胞內的轉運和分泌都很重要。N -糖基化分子也在蛋白質的折疊、加工以及從內質網 (ER) 和高爾基體 (golgi apparatus) 分泌過程中扮演關鍵的角色。基於糖基化對蛋白質功能的巨大影響，對聚糖進行精確的研究和分析是非常必要的。蛋白質糖基化在既有的技術指引中都有特別提及，例如 ICH Q5E 和 Q6B 以及 FDA 發布的產業指南「治療蛋白質生物仿製藥的開發」。

N-糖分析有四種方法可供選擇：完整的糖蛋白、糖肽、釋放糖或單糖。本文將集中討論以超高壓液相色譜法，結合螢光 (FLR) 與質譜 (MS) 檢測，分析釋放的 N-聚糖。本文所介紹的釋放 N-聚糖分析法，是目前最強大且最常用的聚糖成分分析方法之一。螢光衍生化可以透過螢光檢測來相對量化聚糖物種的百分比豐度。在螢光衍生分子中，普羅卡因胺提供了最佳的信號，超越了更傳統的 2-AB 和 2-AA 標籤。此外，普羅卡因胺含有一個叔胺，使其具有良好的電離性，可用於電噴質譜法的聚糖特性分析。親水作用液相色譜 (HILIC) 是一種成熟的聚糖分離和定量技術，與其他 HPLC 分離模式（如反相、陰離子交換）相比具有明顯優勢。

阿達木單抗是一種特異於人類腫瘤壞死因子 (TNF) 的重組人 IgG1 單克隆抗體 (mAb)。它的分子質量約為 150 kDa，並在 Fc 區域上進行 N-糖基化。

General procedure- Sample Preparation and System Setup for Released N-linked Glycan Analysis using UHPLC-FLR-MS

Samples

使用以下方案分析和比較兩個樣品：

• 阿達木單抗參考（Humira^®，來自 Abbvie, Inc.,北芝加哥，伊利諾州）
• MSQC16 SILu™Lite SigmaMAb Adalimumab 單克隆抗體（等效物，來自 Merck 的重組蛋白）

Reference

試劑製備

緩衝劑和酶

• 8M胍HCl，用水製備
  1. 將7.6 g 鹽酸胍溶於水中，使最終體積達到 10 mL
  2. 0.2 mL/樣品（152.85 mg HCl胍/样品）
• 50mM碳酸氢铵（ABC缓冲液），用水配制
  1. 将395 mg ABC溶于100 mL水中
  2. 2 mL/样品（7.需要 91 mg ABC/樣品）
• 1 單位/μL PNGase F
  1. 溶於水中；可等分並在 -20 °C 下保存 6 個月或更長時間

系統適用性試劑

工作流程（包括聚糖釋放、標記和 SPE 清理）也在人血清 (hIgG) 中純化的 IgG 上執行，作為與其他樣品一起處理的對照。

葡萄糖單位 (GU) 階梯使用普羅卡因胺 (procainamide) 標示的葡聚糖水解物，以協助詮釋樣品聚糖。在 BIOshell™ Glycan HPLC 層析柱上進行分析時，GU 階梯會提供從單體葡萄糖到大約 20 個葡萄糖寡糖聚合體的特性剖面。階梯提供校正參考點，有助於根據保留特徵識別更複雜的聚糖。

• hIgG（I4506）用於系統適用性
  hIgG，從人類血清中純化的 IgG，（200 μg）作為系統適用性對照品處理。
  1. 在 8 M 胍 HCl 中製備 10 µg/µL 溶液，然後等分為 200 µg 的份量
  2. IgG的處理方法與樣品相同
  3. 未使用的份量儲存於 -20°C 以備日後使用
  <
• 葡聚糖水解物，普鲁卡因胺标记，用于 HPLC-FLR-MS 系统适用性 GU 梯形图
• 葡聚糖水解物在 25% 75 mM 甲酸铵/75%乙腈（v/v）中溶解，普鲁卡因胺标记根据 2.4

N-糖釋放

分析前，樣品在水中重構至 1 mg/mL 的濃度，每種蛋白質使用 200 µg 進行 N-糖分析。

變性

1. 將加熱塊置於 50 °C
2. 以至少 100 µL 蛋白質開始，pH 值為中性
3. 加入200 µL 8 M HCl胍溶液，快速旋轉混合
4. 在50 °C下孵育30分鐘以變性（可選搖動）
5. 將樣品溫度降至RT

將緩衝液交換至50 mM ABC緩衝液

1. 將樣品轉移到 30 kDa 旋轉過濾器
2. 以 14,000 x g 離心 15 分鐘
3. 加入 400 µL ABC 緩衝液
4. 再次重複前兩個步驟，確保所有溶液都通過過濾器
5. 丟棄流過的液體，將過濾器放入新的收集管中

酵素釋放聚糖

糖的回收

1. 1,000×g下離心10秒，收集蓋子上的冷凝液
2. 加入40 µL ABC緩衝液
3. 14,000×g下離心5分鐘
4. 加入 100 µL ABC 緩衝液
5. 以 14,000 x g 離心 5 分鐘
6. 再重複前兩個步驟一次
7. 將收集管中的聚糖轉移到 0.6 mL 微離心管中進行標示
8. 真空離心蒸發溶劑

普羅卡因胺標示

在一爐還原胺化溶液中用普羅卡因胺標示乾燥的樣品，用正相SPE[CM3]純化，所得的標示產品再乾燥。在進行 UPLC-FLR-MS 之前，會將甘聚糖溶解在 50 µL 的 25% 75 mM 甲酸銨/75% 乙腈 (v/v) 中。
注意：除了稱量試劑之外，所有製備和標籤過程都必須在通風櫃中進行。將培養塊移至通風罩中準備，並將溫度設定為 65 °C.

普羅卡因胺標示試劑

1. 稱取至少 1.8 mg氰基硼氢化钠（NaBH₃CN），每个标记反应在一个试管中
   • 去皮一个微离心管
   • 在通风橱中将NaBH₃CN转移到试管中；鉛筆橡皮擦頭的容量通常就足夠了
   • 蓋上管子，在通風罩中用 N₂ 氣體吹掉灰塵
   • 稱量管子
2. 稱量至少 2.033 倍於 NaBH₃CN 的質量（以質量計），另取一管
3. 準備 9.1 µL 的 70% 二甲基亚砜 (DMSO)/30% 乙酸 (AcOH) (v/v) 溶液
4. 用 70% DMSO/30% AcOH (v/v) 溶液溶解普鲁卡因胺
5. 通过涡旋确保溶液均匀
6. 加入 18.每 mg NaBH₃CN 加入 5 µL 溶解的普鲁卡因胺
   注意：NaBH₃CN不會完全溶解；由於暴露於強酸會釋放氰化物氣體，此步驟特別需要在通風罩中進行
7. 每毫克NaBH₃CN加入5 µL水。L 水，使 NaBH₃CN 完全溶解
8. 蓋上蓋子，在通风橱中以旋涡方式混合，使 NaBH₃CN 完全溶解3CN

聚糖的普鲁卡因酰胺标记

1. 每个样品加入 40 µL 标记试剂到反应溶液中
2. 涡旋混匀。/li>
3. 渦旋 1 分鐘並簡短離心
4. 將蓋好管蓋的試管置於培養箱中，於 65 °C 培養 3 小時
   注意：蓋上鋁箔以限制冷凝在蓋子上，並保持黑暗

SPE清理

1. 準備清理的聚糖，加入200 µL 的 70% ACN 水溶液
2. 準備 Discovery Glycan SPE 管和真空歧管
3. 載入樣品
   • 將微離心管置於濾筒下方，以收集突破液
4. 清洗
   • 加入 1 mL 99% ACN，並利用真空歧管使溶液以最小壓力梯度通過濾筒
   • 重複上述步驟四次
5. 靜置
   • 將新的微離心管置於濾盒下，以收集純化的聚糖
   • 在床中加入200 µL 20% ACN
   • 在重力作用下使体积通过床
6. 真空離心蒸發溶劑
7. 乾燥的標示聚糖可在 -20 °C 儲存至少 6 個月

UHPLC-FLR-MS

溶解聚糖

1. 將乾燥的聚糖溶解於 50 µL 75% ACN / 25% 75 mM 甲酸銨 (v/v) pH 4.4（用甲酸調整），渦旋 2 分鐘
2. 以 16,000 x g 離心 2 分鐘
3. 轉移 40 µL 至自動取樣瓶

UHPLC-FLR-MS參數

儀器配置為 LC 總流量首先通過螢光檢測器。然後以 1:1 的比例分流，一半流向質譜儀，另一半排出。這樣一來，通往電噴發射器的管路阻塞就不會損壞螢光檢測器的流通池。

HPLC 參數
儀器	Waters Acquity UPLC-Waters FLR 螢光偵測器
軟體	Xcalibur
色譜柱	BIOshell™ Glycan 15 cm x 2.1 mm I.D.、2.7 µm 以流動相梯度起始條件平衡色譜柱， 60 分鐘。
色谱柱温度	58°C
色谱柱平衡时间	两次进样间隔30分钟
樣品管理溫度	8°C
移動相	移動相A：75 mM 甲酸銨 pH 4.4 流動相 B: 乙腈
梯度	梯度：75% B - 59% B 於 75 分鐘內完成
流量	0.3 mL/min
注射方式	局部循環
注射量	10微升
運行時間	110分鐘

MS 設定
儀器
離子源	IonMax
離子源	ESI
DDA 模式	每台 MS 一個 MS2，最豐富離子，任何電荷狀態
數據依賴排除	3 s
隔離寬度	5達
正態化碰撞能量(%)	30
毛細管 (V)	4000
毛細管溫度	200°C
護套氣體	10
助燃氣體
掃描範圍 (Da)	400-2000

樣品分析

1. 在樣品清單開始時執行 1-2 個空白樣品
2. 先分析葡聚糖階梯圖和 hIgG 樣品
每5個樣品後運行一個空白樣品，然後運行葡聚糖GU階梯，以更新GU值
3. 在樣品之後和柱沖洗之前運行一個空白樣品
4. 排隊完成後，用水沖洗柱 30 分鐘，然後用 80% ACN/20% 水沖洗柱 30 分鐘，並儲存

數據分析

LC峰根據其洗脫的葡萄糖單位（GU）計算出的殘留成分水平（表 1）來識別。每種 LC 特徵的保留時間的 GU 含量是根據右旋糖酐水解物梯度色譜的 5 次多項式標準曲線插值確定的（圖 1）。通过将 GU 值与 BIOshell™ 柱的自定义糖类 GU 值数据库进行比较，完成糖类分配。每五個樣品之後，透過 UHPLC FLR-MS 分析葡聚糖階梯，以校正任何保留時間的偏移。對於相對定量，螢光峰面積會歸一化為所有已識別的聚糖螢光峰面積之和。定量限 (LOQ) 定義為最豐富峰區的 0.5%。此參數允許成分少於總峰區的 0.5%，因為成分是以所有峰區總和歸一化的。使用 Xcalibur Qual Browser 計算峰面積。對於一般樣品分析，Thermo Xcalibur Qual Browser 軟體會擷取並記錄每個樣品的基本峰強度。

表 1. Glycan 成分單糖。

Glycan/Modification	簡稱	通用名	殘餘質量
Procainamide Modification	-	-	219。/th>	符號
Procainamide Modification	-	-	219.17	-
N-Acetylglucosamine	GlcNAc	HexNAc	203.08
Mannose	Man	Hex	162。05
半乳糖	Gal	Hex	162。05
Fucose	Fuc	Fuc	146.06
N-Acetylneuraminic Acid	Neu5Ac	Neu5Ac	291.10

Released N-linked Glycan Analysis Results

System suitability results

普鲁卡因胺标记的葡聚糖 GU ladder 和对照采集结果表明，UHPLC-FLR 系统和色谱柱适用于解析和鉴定标记的寡糖，符合 Table 2 中所示的四项系统适用性要求。首先用 hIgG 測試工作流程，包括糖釋放、標記和 SPE 清理，結果發現可以接受，可以檢測到 14 種常見的 hIgG 糖。至少需要 10 個 hIgG 聚糖鑑定。第二個系統適用性要求也得到了滿足；在螢光色譜圖中觀察到峰 G1F (1,6) 和 G1F (1,3) 得到了部分解析（圖 1）。虽然 G1F (1,6) 和 G1F (1,3) 峰之间的分辨并不完全，但放大后可以直观地区分。hIgG 對照也符合第三項系統適用性要求。該樣本中具有代表性的聚糖子集的相對豐度與歷史聚糖輪廓的 R² 相關度為 0.99。最後，在分析 hIgG 對照樣本時所建立的斜率為 0.99，符合 1.00 ± 0.07 的斜率要求。

表 2. hIgG 的四種系統適用性要求和結果。

類型	標準	結果
Qualitative	≥10個hIgG峰被偵測到
G1F(1,6); G1F(1,3) 部分解決	是
定量	相關係數 R2≥ 0.95	0.99
斜率 1.00 ± 0.07	0.99

圖 1. 普羅卡因胺標示葡聚糖 GU 階梯和 hIgG 對照的螢光色譜圖。頂部窗格：註釋表示每個葡聚糖水解物-普羅卡因胺特徵中葡萄糖單位 (GU) 的數量。底部窗格中對照 hIgG 的每個特徵都經過類似鑒定。插圖顯示聚糖特徵相對組成與先前 hIgG 資料歷史值的相關性。

阿达木单抗样本结果

对阿达木单抗样本的16个聚糖特征进行了量化。 表3包含所有样本的聚糖组成。  图2说明了阿达木单抗每种样本类型的荧光色谱图。表 4說明了觀察到的聚糖結構。圖 3 顯示 MS 圖譜的典型範例。

圖 2. 阿达木单抗样品的荧光色谱图；参考（上）和 MSQC16（下）。編號特徵在表 3中列出。

表 3. N-Glycan % 構成。

Peak	Glycan	Adalimumab Reference (%)	MSQC16 (%)
1	G0-N	0.6	0.5
2	G0F-N	4.1	0.6
3	G0	0.9	3.1
4	男5	5.3	1.0
5	G0F	65.0	44.4
6	G1F-N	1.7	-
7a	G1(1,6)	0.4	1.1
7b	G1(1,3)	0.4	0.7
8	Man6	1.8	-
9a	G1F(1,6)	12.1	29.6
9b	G1F(1,3)	5.1	10.0
10	G2F	2.7	7.3
11	G1FS(1,3)	-	0.5
12a	G2FS(1,6)	-	0.6
12b	G2FS(1,3)	-	0.4
13	G2FS2	-	0.4

圖 3. 圖 2中的峰值 4 (Man 5) 和峰值 5 (G0F) 觀察到的 MS 光譜典型示例。

表 4. 觀察到的 N-糖。

峰值	RT (min)	RT GU (min)	理論質量	Monosaccaride Composition	Structure
1	10.46	5.29	1332.58	G0-N	Man3 GlcNAc3
2	11.83	5.75	1478.64	G0F-N	Fuc1 Man3 GlcNAc3
3	12.80	6.07	1535.66	G0	Man3 GlcNAc4
4	13.66	6.35	1453.61	Man5	Man5 GlcNAc2
5	14.17	6.51	1681.72	G0F	Fuc1 Man3 GlcNAc4
6	14.56	6.65	1640.69	G1F-N	Fuc1 Man3 Gal1 GlcNAc3
7a, 7b	15.36 15.62	6.91 6.99	1697.71	G1	Man3 Gal1 GlcNAc4
8	16.44	7.28	1615。66	Man6	Man6 GlcNAc2
9a, 9b	16.68 16.87	7.35 7.42	1843.77	G1F	Fuc1 Man3 Gal1 GlcNAc4
10	19.27	8.26	2005.82	G2F	Fuc1 Man3 Gal2 GlcNAc4
11	21.09	8.94	2134.9	G1FS	Fuc1 Man3 Gal1 GlcNAc4 Neu5Ac1
12a, 12b	23.23, 23.47	9.78, 9.88	2296.92	G2FS	Fuc1 Man3 Gal2 GlcNAc4 Neu5Ac1
13	27.23	11.56	2588.01	G2FS2	Fuc1 Man3 Gal2 GlcNAc4 Neu5Ac2

結論

我們開發了一套完整的 UHPLC-FLR-MS 工作流程來簡化 N 連結聚糖的分析。此工作流程具有以下優點：

• MS和螢光相容性
• 使用人IgG進行系統適用性測試
• 快速且可重複的N-聚糖釋放。該方案涉及多個洗滌步驟和變性 mAb 的過夜消化
• 普羅卡因酰胺標籤確保了高螢光強度和電噴電離效率，同時與其他螢光標籤系統相比，顯示出可比較的色譜分離度
• BIOshell™ HPLC 膠柱用於 UHPLC-FLR-MS 分析：適用於使用親水交互液相色譜 (HILIC) 的典型流動相分析蛋白質連結糖
• 完整列出所有試劑、耗材及相關產品。

針對 mAb 阿達木單抗，共量化了 16 個聚糖特徵。^1,2

對治療用 mAb 的糖基化模式進行表征和監測是監管機構的要求，以確保這些藥物的療效和安全性。

本詳細方案可用於分析 mAbs 的 N 鏈連接的聚糖，以及複雜和異質的糖蛋白。

參考資料

1. Lee N, Lee JJ, Yang H, Baek S, Kim S, Kim S, Lee T, Song D, Park G. 2019. Evaluation of similar quality attribute characteristics in SB5 and reference product of adalimumab. mAbs. 11(1):129-144. https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1530920

2. Tebbey PW, Varga A, Naill M, Clewell J, Venema J. 2015. Consistency of quality attributes for the glycosylated monoclonal antibody Humira® (adalimumab). mAbs. 7(5):805-811. https://doi.org/10.1080/19420862.2015.1073429