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首頁生物製藥特性單株抗體的純化、可選還原及 SEC-MS 分析規範

單株抗體的純化、可選還原及 SEC-MS 分析規範

Stephan Altmaier1, Pegah Jalili2, Uma Sreenivasan3, Kevin Ray2

1Darmstadt, Germany, 2St.Louis, MO, USA, 3Round Rock, TX, USA

阿達木單抗的完整和中間質量分析工作流程

我們開發了一套完整的 SEC-MS 工作流程，以簡化非還原和還原單克隆抗體 (mAbs) 的完整質量分析。

詳細內容包括

  • 使用固定化蛋白 A 純化抗體
  • 還原抗體程序（可選）
  • 質譜儀校正
阿達木單抗的完整和中間質量分析工作流程

單株抗體的特性及 SEC-MS 在完整和亞基質量分析中的作用

單株抗體（或免疫球蛋白 - IgG）是分子量約為 150 kDa（150,000 g/Mol）的大型糖蛋白。它們是由兩條相同的輕鏈（LC，每條分子量約 25 kDa）和兩條相同的重鏈（HC，每條分子量約 50 kDa）透過共價鏈間和鏈內二硫鍵連結而成。

謹慎而徹底的治療用 mAbs 特性分析對於確保藥物的安全性和有效性至關重要。mAbs 通常是在生物反應器中以哺乳動物宿主細胞系製造，產生大量的異質藥物分子。為每一種 mAb 建立關鍵品質屬性 (CQAs) 並證明生產批次在可接受的範圍內，對於創新藥廠和生物仿製藥廠來說都是非常重要的要求。1,2

在許多情況下，以抗體為基礎的藥物的表徵是使用特定的色譜技術（例如、3,4與質譜法 (MS) 結合。）這種組合允許進行不同類型的分析，例如，完整 mAb 和亞基的精確質量測量、肽圖，以及轉譯後修飾（如糖基化、氧化和去酰胺化）的測定。

有幾種技術應用於簡化抗體分析，方法是破碎或去除聚糖。後者可用 PNGase F 處理，而用 IdeS5 蛋白水解或用還原劑（如二硫蘇糖醇）還原鏈間的二硫鍵，可形成質量為 25 - 50 kDa 的不同抗體片段。這些技術的各種組合都可以應用。6這些方法稱為完整質量和中間分析方法。7前者是指在未進行控制解離的情況下測量完整 mAb 的質量。此類實驗可揭示有關計量、蛋白質形式和修飾的資訊。中段實驗包括透過化學還原或蛋白質分解將 mAb 裂解成幾個大片段/亞基後的質量測量。這種方法的一個例子是分析 mAbs 輕鏈和重鏈，以深入瞭解各鏈的轉譯後修飾。 圖 1 提供了完整質量分析前抗體樣品製備和各種消化選項的概覽。

以蛋白 A 親和淨化及化學和蛋白分解法製備抗體樣本

圖 1.抗體樣品製備

本報告介紹了應用非還原和還原SEC-MS工作流程生成阿達木單抗的完整質量和中間質量數據。

在所有實驗中，都使用重組人類抗體標準 SILuTM Lite SigmaMAb (#MSQC4) 作為參考和檢測控制樣品。文中簡稱為 SigmaMAb，儘管市場上也有多種不同的 SigmaMAb 標準。

一般程序 - 样品和参考制备以及抗体纯化和 SEC-MS 的系统设置

抗体纯化程序

目标抗体纯化是在细胞培养上清液中使用固定蛋白 A 树脂在 96 孔格式中进行的。建議的最低工作 mAb 滴度為 100 μg/mL。

所有程序均使用分子質量為 ~150 kDa 的 SigmaMAb 參考樣品和檢測控制樣品進行。參比樣本由在水中重組的純抗體組成；用於系統適用性測試和儀器檢查。檢測對照樣本包含添加到細胞培養基或乏培養基（包括營養物等的細胞肉湯）中的抗體，或以混合物的形式遞送；它通過整個工作流程並作為對照樣本。

詳細來說，使用蛋白 A 樹脂從細胞培養基中高通量純化 mAbs 的過程如下：

  1. 系統/工作流程適用性 
    作為工作流程適用性的一部分，SigmaMAb      在培養基中的檢測對照與樣品一起進行純化。參考樣品（SigmaMAb）的製備方法如下：[SA1]
    • 將每小瓶 MSQC4 重製於 1.0 mL 水中，以獲得抗體濃度為 1 mg/mL 的溶液。
    • 將 SigmaMAb 加入 EX-CELL® CHOZN® 平台培養基或等效培養基中，以獲得 100-500 µg/mL 的最終濃度，製備檢測對照（用過的培養基樣本）。
  2. 平衡和洗脱缓冲液的制备
    • 将 5.82 g 二水柠檬酸三钠、0.04 g 柠檬酸和 8.77 g 氯化钠溶于 1 L 水中，制备平衡缓冲液（20 mM 柠檬酸，150 mM NaCl，pH 7）。根據需要使用 1 M NaOH 或 HCl 將所得溶液的 pH 調至 7；然後使用 0.2 μm 過濾器過濾溶液。根據需要使用 1 M NaOH 或 HCl 調整所得溶液的 pH 值至 3。
  3. 淨化樣本
    試管中的樣本以最大速度離心 5 分鐘，平板中的樣本以最大速度離心 60 分鐘。
  4. 蛋白 A 加載
    • 加入或除去沉澱的蛋白 A 漿液上部的水，以獲得 50% 的蛋白 A 懸浮液。
    • 通過持續的移液動作和輕輕搖動試劑槽來混合漿液。
    • 使用多道移液管將 200 μL 蛋白質 A 漿液注入 96 孔過濾板的每個孔中。將蛋白質 A 篩板放在真空歧管上。
  5. 蛋白 A 平衡
    • 在蛋白 A 的每個孔中加入 200 μL 平衡緩衝液，並在緩衝液的空孔中抽真空。
    • 兩個步驟重複兩次。
  6. 清洗結合的 mAb
    • 將蛋白 A 篩板放置在真空歧管上，插入廢液收集板並移除薄膜蓋。
    • 將緩衝液培養基孔抽真空，然後將濾板轉移到廢液收集板上。
    • 向孔中加入 200 μL 平衡緩衝液，以 3700 rpm 離心 5 分鐘（此步驟有助於清除濾板孔側的樣品薄膜）。
    • 再重複一次，共洗三次。
  7. 接合結合的 mAb
    • 將蛋白 A 篩板放在新的收集板上，並用橡皮筋固定。
    • 每孔加入 100 μL 洗脱緩衝液，將過濾板放在軌道搖盤上以 170 rpm 溫育五分鐘。
    • 重複加入洗滌緩衝液、在軌軸振動器上培養、離心，共進行三個洗滌步驟（總洗滌量為 300 μL）。

抗体还原步骤

二硫键（S-S）还原步骤如下：

  1. 制备 1 M 二硫苏糖醇（DTT）溶液，将 154.25 mg DTT 溶于 1 mL 水中。
  2. 将 79.06 mg ABC 溶于 1 mL 水中，制备 1 M 碳酸氢铵（ABC）溶液。
  3. 將每個樣品、系統適用性參考品和對照品的 50 μL 等分樣本轉移到自動取樣瓶中。
  4. 還原時加入 5 μL 0.5 M ABC/0.5 M DTT 溶液。
  5. 室溫培養一小時或 37 °C 培養 30 分鐘。

注意：還原是在非變性條件下進行的，在此條件下，鏈間二硫鍵（更易受還原影響）會斷裂並產生輕鏈和重鏈，而每個單獨結構域內的鏈內二硫鍵保持完整。

另外，也可以使用以下方案來還原樣品：

  1. 在 6 M 鹽酸胍水溶液中製備 100 mM 的三(2-羧乙基)膦 (TCEP) 溶液，將 2.87 g TCEP 和 57.32 g 鹽酸胍溶於 100 mL 水（如果需要的溶液較少，可相應減少）。
  2. 將 30 μL 所得到的溶液與 10 μL 樣品混合。
  3. 在 37 °C 下培養兩小時。

注意：還原是在變性條件下進行，鏈間和鏈內的二硫鍵（更易受還原影響）都會斷裂。

儀器校正

Waters QToF Xevo G2XS 質譜儀以 20 μL/min 注入 0.4 mg/mL 碘化銫水進行校正，質量範圍為 500 - 6000 m/z。

系統適用性

為評估整個工作流程的性能，製備了檢測對照（介質中的 SigmaMAb），並與樣本一起進行分析。

此外，還分析了還原的 SigmaMAb 抗體參考（以 2 mg/mL 配製，並進一步稀釋至 1 mg/mL）與樣本，以確定 SEC-MS 平台的系統適用性。

SEC-MS系統設置和MS數據分析

SEC-MS系統設置

用於分析還原和非還原抗體的UHPLC-PDA色譜系統和qToF質譜儀的基本設置如下表1和表2所示。

儀器Waters H-Class Acquity UPLC 色譜系統
軟體MassLynx 4.1
色譜柱Tosoh TSK Gel SW3000XL, 300x2.0mm, 4 μm
色谱柱温度环境温度
自動取樣器溫度8 °C
移動相乙腈/水 30/70 (v/v) + 0.1% TFA
梯度等度
流量0.1 mL/min
迴圈容量20微升
注射方式局部循環或全循環
注射量
運行時間10 分鐘
光電二極體陣列280奈米
分流6.7 - 9.9 min
表 1.UHPLC-PDA 設定。
儀器Waters QToF Xevo G2X2 Mass Spectrometer
軟體MassLynx 4.1
毛細管 (V)3,500
取樣錐 (V)45
萃取錐 (V)3
離子導向 (V)3
解溶溫度 (°C)<100
來源溫度 (°C)300
掃描範圍 (Da)400 - 4,000
溶劑氣體 (L/h)<40
600
碰撞能量 (V)5
推力 (V)930<
RF 設定自動檔案
表 2.qToF-MS 設定。

MS 資料分析

使用 MassLynx 4.1 軟體中的 MaxEnt1 模組處理資料，以產生和分析去卷積 (零電荷) 質譜。一般而言，從洗脫的完整 mAb、重鏈 (HC) 或輕鏈 (LC) 的相對應總離子色譜圖 (TIC) 中產生和譜。然後利用 MaxEnt1 演算法處理總和的 m/z 光譜。詳細參數列於表 3.

對於糖形分析，使用 Waters 的 UNIFI 軟體處理資料。該軟體對糖形進行匹配，HC 糖形聚糖列於下文各節。糖型相對豐度資料是根據共結糖型物種的峰強度製成表格。為了排除雜訊的納入，使用了基峰強度為 2% 的解卷积濾波器設定，並使用了 5 Da 的輸出解析度設定。

非還原質量
m/z 範圍全光譜範圍
破壞模型高斯模型, FWHM 3 Da
解析度 (Da/通道)2
質量範圍 (Da)140,000 - 160,000
最小強度比，L 和 R (%)33
迭代30
背景減除後MaxEnt125th階，5%，0.01% 公差
中心光譜峰寬半高 20.中心頂30%，高度
還原 - 重鏈
m/z範圍1,200-3,000
損壞模型高斯，FWHM 0.5 Da
解析度 (Da/通道)1
質量範圍 (Da)40,000 - 60,000
最小強度比，L 和 R (%)33
迭代12
還原 - 輕鏈
m/z 範圍1,000-2,600
損壞模型高斯模型, FWHM 0.5 Da
解析度 (Da/通道)1
質量範圍 (Da)20,000 - 25,000
最小強度比，L 和 R (%)33
迴圈數12
表 3.解卷參數。

阿达木单抗SEC-MS完整和中间向上分析结果

非还原阿达木单抗的完整质量分析

分析目的是对所有提交的样品进行非还原SEC-MS完整质量分析，以验证阿达木单抗的分子量。

對阿達木單抗和 SigmaMAb 抗體對照樣本進行蛋白 A 純化，方法如前文所述。完整的 SigmaMAb 用於確定系統的適用性。所有 mAb 樣品均在 100 μL H2O 中溶出，以獲得 1 mg/mL 的最終濃度。

系統適用性測試結果

在 SEC-MS 系統上注入 SigmaMAb 參考樣品（10 μL）。圖 2展示了未還原抗體的光電二極體陣列（280 nm）和 TIC（總離子電流）痕跡，而圖 3則顯示了 SigmaMAb 參考品的解卷曲質譜。觀察到的完整 mAb 糖型與 MSQC4 的常見糖型質量相符，如 Table 4 所列。四種糖型的觀察質量與理論值之間的測量差異在 0.005% 的質量誤差之內。

未還原 SigmaMAb 參考品的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

圖 2.未還原 SigmaMAb 參考品的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

未還原 SigmaMAb 參考品的解卷积質譜

圖 3.未還原 SigmaMAb 參考品的解卷积質譜。

品種分子式理論質量 (Da)*觀測質量 (Da)誤差 (Da)誤差 (%)
重鏈/G0FG0FC6486H10048N1716O2070S46146658146665+7+0.005
重型鏈條/G0FG1FC6492H10058N1716O2075S46146821146823+2+0.001
重型鏈條/G1FG1FC6498H10068N1716O2080S46146983146982-1-0.001
重型鏈條/G1FG2FC6504H10078N1716<.../sub>O2085S46147145147140-5-0.003
表 4.非還原型 SigmaMAb 參考糖型的觀測質量和理論質量。

G0F: GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G1F: GalGlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G2F: Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
*質量基於 NIST 物理參考數據

。

非還原樣品結果

使用 SEC-MS 分析了非還原形式的單株抗體樣品。阿達木單抗相應的光電二極體陣列（280 nm）痕跡、TIC、MS 圖譜以及經解縮分的 MS 圖譜如圖 4 和圖 5所示。如表 5所示，所有提交樣品的非還原 mAb 的觀察質量與計算的理論質量關聯良好，觀察質量誤差為 0.010% 或更小。

未還原阿達木單抗的光電二極體陣列（280 nm，左圖）和 TIC 軌跡（右圖）。

圖 4.未還原阿達木單抗的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

未還原阿達木單抗的 MS 數據。左圖：總和光譜；右圖：解卷光譜。

圖 5.未還原阿達木單抗的 MS 數據。左圖：總和光譜；右圖：解卷光譜。

品種分子式理論質量 (Da)*觀測質量 (Da)誤差 (Da)誤差 (%)
重鏈/G0FG0FC6267H10040N1898O1906S15148080148082+2+0.001
重型鏈條/G0FG1FC6273H10050N1898O1911S15148242148244+2+0.001
重型鏈條/G1FG1FC6279H10060N1898O1916S15148405148398-7-0.005
重型鏈條/G1FG2FC6285H10070N1898O1921S15148567148552-15-0.010
表 5.未還原阿達木單抗的計算和實驗質量。

G0F: GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G1F: GalGlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G2F: Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
*質量基於 NIST 物理參考數據

。

還原阿達木單抗的完整質量分析

完整質量分析的目的是通過應用SEC-MS中間向上的方法驗證阿達木單抗輕鏈和重鏈的分子量。

對含有表達的阿達木單抗和SigmaMAb檢測對照的細胞培養上清液樣品進行蛋白A純化，如上節所述。還原的 MSQC4 參考被用來確定系統的適用性。所有 mAb 樣品均在 100 μL H2O 中溶出，最終濃度為 1 mg/mL。

系統適用性測試結果

在 SEC MS 系統上注入 10 μL 還原的 SigmaMAb 參考樣本。觀察到的重鏈 mAb 糖型與 SigmaMAb 的預期糖型質量相符，如 表 6 所列。圖 6顯示 SigmaMAb 參考品的 UV 色譜圖 (280 nm) 軌跡，而圖 7則顯示還原 SigmaMAb 參考品輕鏈和重鏈糖型的總和及分卷質譜。

還原 SigmaMAb 參考品的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

圖 6.還原 SigmaMAb 參考品的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

還原 SigmaMAb 參考品輕鏈和重鏈（分別為左側和右側）的總和（上圖）和分卷（下圖）質譜。

圖 7.還原 SigmaMAb 參考品輕鏈和重鏈（分別為左側和右側）的總和（上圖）和分卷（下圖）質譜。

種類分子式理論質量 (Da) 完全還原內二硫鍵理論質量 (Da) 部分還原觀測質量 (Da)誤差 (%)
輕鏈C1006H1555N267O333S722,942.22 (-4 Da)22,938.222939+0.003
重鏈/G0FC2237HN591O702S1650,403.24 (-8 Da)50,395.250395+0.001
重鏈/G1FC2243HN591O707S1650,565.34 (-8 Da)50,557.350556+0.002
重鏈/G2FC2249HN591O712S1650,727.54 (-8 Da)50,719.550718 -0.003
表 6.還原 SigmaMAb 參考輕鏈和重鏈糖型的觀察質量和理論質量（理論質量根據 NIST 物理參考數據計算）。

G0F: GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G1F: GalGlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G2F: Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
*質量基於 NIST 物理參考數據

。

還原樣品的結果

還原的阿達木單抗樣品使用 SEC-MS 進行分析。相應的光電二極管陣列（280 nm）痕跡、TIC、MS 圖譜以及總和和分卷的 MS 圖譜顯示在個別的 圖 8 和圖 9中。如表 7所示，測得的還原型質量與計算質量關聯良好（質量誤差在 0.005% 或以下）。對於所有提交的樣品，還原輕鏈和重鏈的去卷積質量與預期的計算質量關係良好。

還原阿達木單抗的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

圖 8.還原阿達木單抗的光電二極體陣列 (280 nm，左) 和 TIC 軌跡 (右)。

還原阿達木單抗輕鏈和重鏈（分別為左側和右側）的 MS 數據。上圖：總和光譜；下圖：去卷縮光譜。

圖 9.還原阿達木單抗的輕鏈和重鏈（分別為左側和右側）的總和（上圖）和分卷（下圖）質譜。

種類分子式理論質量 (Da) 完全還原*內二硫鍵理論質量 (Da) 部分還原*觀察質量 (Da)誤差 (%)
Light chainC1027H1610N282O332S623411.92 (-4 Da)23407.923407-0.004
重鏈/G0FC2247HN586O716S1550644.34 (-8 Da)50636.350636-0.001
重鏈/G1FC2253HN586O721S1550806.54 (-8 Da)50798.550797-0.003
重鏈/G2FC2259HN586O726S1550968.64 (-8 Da)50960.650958-0.005
表 7.還原阿達木單抗輕鏈和重鏈糖型的計算質量和實驗質量（理論質量根據 NIST 物理參考數據計算）。

G0F: GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G1F: GalGlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
G2F: Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc
*質量基於 NIST 物理參考數據

。

結論

以阿達木單抗 (adalimumab) 為模型 mAb，以 SILuTMLite SigmaMAb 為參考和檢測控制樣品，開發了一套 SEC-MS 完整和中間質量分析還原和非還原單株抗體的工作流程。

工作流程包括使用固定化蛋白 A 的抗體純化程序、可選的 mAb 還原程序、質譜儀校正方法，以及使用重組人類單克隆抗體參考樣本的系統適用性測試。

非還原 SigmaMAb 參考品的結果顯示，四種糖型的觀察質量與理論值之間的測量誤差為 0.005% 或更小。

分析還原的 SigmaMAb 參考樣本發現，觀察到的重鏈 mAb 糖型與預期的抗體糖型質量相符。三種糖型的觀察值與理論值之間的差異都在 0.003% 的質量誤差之內或更小。

實驗數據證明，該工作流程可用於還原或非還原的單克隆抗體樣品分析，其準確的結果可對各種糖型進行明確的鑑定。

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參考資料

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