超濾法的病毒濃度

• Virus Isolation, Propagation, and Characterization
• General Methods for Viral Propagation<
• 使用 Amicon^® Ultra 離心式超濾裝置的病毒濃縮
• 離心超濾設備

病毒的分離、傳播和特性分析

圖 1. 超濾用於濃縮病毒。液體通過膜過濾器，而大的病毒粒子則被保留下來。

病毒分離和繁殖方法在研究、疫苗生產和診斷工作流程中至關重要。基礎研究實驗室使用病毒庫存來研究病毒生物學和發病機制。疫苗生產需要小規模或大規模的病毒製備。雖然目前大多數診斷實驗室都使用非培養方法來診斷病毒性疾病，但在需要有活力的病毒分離物、必須區分有活力和無活力的病毒，以及以培養為基礎的方法能比非培養方法更快提供結果的情況下，細胞培養中的病毒分離仍是有用的方法。

病毒可在細胞培養中繁殖，以產生病毒庫存。培養細胞接種來自種子病毒、商業來源或受感染組織的病毒庫存。培養後，裂解受感染的細胞以收集病毒粒子，或直接從細胞上清液中收集釋放的病毒。

從臨床樣本分離病毒也是利用細胞培養來繁殖病毒。

為了獲得高滴度的病毒庫存，必須濃縮純化的病毒粒子。具有再生纖維素膜的 Amicon^® Ultra 和 Centricon^® Plus 離心超濾裝置可用於濃縮病毒和病毒溶液（圖 1）。本方案描述了使用Amicon^® 和Centricon^® 離心超滤装置浓缩三种常见类型的病毒：慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）。

病毒繁殖的一般方法

1. 包裝細胞：培養宿主細胞，使其達到 80-85% 的融合度。
2. 轉染：用有活力的病毒粒子感染細胞。
3. 收穫病毒：根據病毒的不同，使用細胞上清液或造粒細胞或兩者來純化重組病毒。使用四輪冷凍/解凍循環從細胞中釋放病毒。然後用離心法從細胞裂解液中分離細胞碎片：用密度梯度超速離心法或柱/膜層析法從細胞裂解液中純化病毒。
4. 使用被動透析、重過濾或使用 Amicon^® Ultra 和 Centricon^® Plus 70 裝置進行離心超濾，將純化的病毒溶液濃縮並將緩衝液交換到適當的儲存溶液中。

高滴度病毒庫存的病毒濃縮

要製造高滴度病毒庫存，可使用離心超濾來濃縮純化的病毒。正確選擇裝置、膜材料、分子量限制或截止值、離心速度、離心時間和緩衝液成分，對高回收率的感染性病毒粒子至關重要。Amicon^® Ultra離心超濾裝置的濾膜有特定的標稱分子量限制（NMWL）。Amicon^® Ultra離心超濾裝置的NMWL為50 kDa Ultracel^® 用於濃縮腺病毒和腺相關病毒（AAV）溶液。對於慢病毒濃縮，則使用 50 kDa 和 100 kDa NMWL 膜的裝置。

選擇超濾方法和膜標稱分子量大小時需要考慮的因素：

1. 病毒顆粒大小：大小可以從公佈的資料來源估算，或通過顯微鏡、激光衍射和動態光散射等測量技術估算。
2. 溶液中主要分離目標的尺寸：需要分離的蛋白質、抗體、藥物、化學品和其他顆粒的尺寸會影響膜尺寸的選擇。
3. 樣品體積：處理量從≤0.5 mL 到 70 mL，都與離心超濾 (cUF) 裝置相容。

為了保留病毒粒子，濾膜的分子量截止值需要比粒子小（~2 倍小於病毒粒子的分子量），但又要大到足以讓較小的成分過濾
（表 1）。

表 1. 根據病毒粒子大小選擇超濾膜 NMWL。

Ultrafiltration Membrane NMWL (kDa)	Nominal Pore Size (nm)	推薦的超濾標稱截留尺寸範圍 <
		直徑 (nm)<		Molecular Weight (kDa)		Molecular Weight (kDa)
		Minimum	Maximum	Minimum <	Maximum
3	0.3	1	1.5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

使用Amicon^® Ultra離心超濾裝置濃縮病毒

表2顯示了從粗細胞裂解物和經層析純化的病毒中濃縮腺病毒、慢病毒和AAV的結果。使用Amicon^® Ultra離心超濾裝置，病毒粒子能有效濃縮至高滴度，且回收率高。

表 2. 使用超濾裝置濃縮病毒。由於潛在的病毒聚集，我們不建議濃縮病毒至高於 1013 粒子/毫升。

起始樣品	裝置	起始病毒滴度	起始容量 (mL)	濃縮因子	Recovery (%)
粗細胞裂解液中的腺病毒	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	27X	20	>100
純化的腺病毒，在1M鹽緩衝液中	Amicon® Ultra-4 50 kDa<	1 x 108	4	45X	10	85
Amicon® Ultra-4 50 kDa	2 x 107	4	20X	35	50
粗細胞裂解液中的 AAV	Amicon®	2 x 107	10	25X	45	76
AAV 稀釋於 100 mM Tris, 250 mM NaCl 緩衝液中	Amicon® Ultra-4 50 kDa	5 x 106	4	20X	20	100
9 x 10	4	100X<	30	>100
Lentivirus in cell cultivation supernatant	Amicon®< Ultra-4 50 kDa	9 x 104	4	100X	30	93
Centricon Plus-70 100 kDa	8 x 103	65	80X	30	81

請務必記住，大多數病毒無法在低鹽緩衝液中有效濃縮和儲存。在 < 250 mM 鹽溶液中離心濃縮病毒會導致病毒聚集和感染性降低。

濃縮後的病毒庫存可通過 0.22 µm 过滤器。 Ultrafree^®-MC GV 过滤器单元 可用于体积为 < 0.5 mL。

結論

我們開發了一種方法來驗證使用Amicon^® Ultra和Centricon^® Plus離心裝置作為一種快速且具成本效益的方法，以獲得高滴度的病毒。此方法可用於濃縮細胞培養上清、細胞裂解液和其他來源的病毒。濃縮後的病毒庫存可使用 Ultrafree^® 過濾器進行過濾消毒。為了獲得最高的感染性病毒粒子回收率，選擇適當的超濾裝置、膜過濾器、分子量截斷值 (MWCO)、離心速度和離心時間至關重要。

離心式超濾裝置

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Device Nominal Molecular Weight Limit, NMWL (kDa)	Amicon® Ultra 離心式超濾裝置				Centricon Plus 70 離心裝置
	0.5 mL	2 mL	4 mL <	15 mL
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003<	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050<	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

* 已註冊作 IVD 使用

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