Sepharose Big Beads：從粗糙、黏稠樣品中進行大規模純化

使用 Sepharose Big Beads 從粗糙、粘稠的樣品中純化蛋白質。

當處理必須快速結合的大量粗糙或粘稠樣品時，以及當解析度不太重要時，請使用 Sepharose Big Beads。

在粘度和背壓可能限制較小粒度離子交換器的處理量時，使用 Sepharose Big Beads 進行俘獲步驟。

在ÄKTAdesign、FPLC System和HPLC等系統或使用蠕動泵的系統上運行裝有Sepharose Big Beads的色譜柱。 Appendix 4 gives guidance on how to choose the most suitable ÄKTAdesign system.

Sepharose Big Beads是專為大規模工業應用而設計的離子交換器。該介質基於 100-300 μM、交聯的 6% 瓊脂糖顆粒，以季銨（Q）或磺丙基（SP）取代。顆粒尺寸大，加上高度交聯，具有極高的物理及化學穩定性，可確保在處理黏度極高的樣品時，仍能維持高流速。例如，在粘度高達水的 2.5 倍時，仍可在工業流程中維持 500 cm/h 的流量。更稀的樣品可以 1000 cm/h 的流速進行處理。儘管離子強度或 pH 值發生變化，顆粒尺寸和床層體積仍然保持穩定。強離子交換基團（Q 和 SP）可在寬廣的 pH 值範圍內保持其電荷，從而為每種應用選擇最合適的 pH 值。

圖 67 和 68 顯示了 Big Bead 介質的優異流動特性和典型結合能力。

圖 67. Sepharose Big Beads 可讓高黏度樣品達到高流速。

圖 68. SP Sepharose Big Beads 的典型結合能力。在 pH 值為 5 的醋酸鹽中測量牛血清白蛋白的結合能力，在 pH 值為 4.1 的甲酸鹽中測量 b-乳球蛋白的結合能力，線性流速分別為 12 cm/h 和 300 cm/h。

淨化選項

產品	結合容量/毫升介質	建議工作流量	最大流量*	工作pH值範圍**	最大工作背壓*** (MPa/psi) 1 MPa=10 bar
強負離子交換器
Q Sepharose 大珠	針對每個特定應用進行測試	高達 300 cm/h	1800 cm/h	2-12	0。3/43
強陽離子交換器
SP Sepharose Big Beads	針對每個特定應用進行測試	最高可達 300 cm/h	1800 cm/h	4-13	0。3/43

*Appendix 5 to convert linear flow (cm/hour) to volumetric flow rates (mL/min) and vice versa.
**工作pH值範圍是指介质按預定或洗脫所需結合蛋白質而無不良長期影響的pH值區間。
***最大工作背壓是指介質開始壓縮的壓力。

在方法開發過程中，特別是處理粗糙、黏稠樣品時，適用於色譜柱填料：

***最大工作背壓是指介質開始壓縮的壓力。

欄位	容量	床身高度
XK 16/20	最高可達 30 mL	最高可達 15 cm
XK 26/20	最高可達 80 mL	最高可達 15 cm<
XK 26/40	最大至 196 mL	> 15 cm
XK 50/20	最高可達 274 mL	最高可達 14 cm
XK 50/30	最高可達 559 mL	最高可達 28.5 cm

選擇生產規模的色譜柱，如 BPG 或 Chromaflow，以獲得更大的用量。Sepharose Big Beads 可通過施加 1-3 bar 的恒壓、漿體沉澱後適配器壓縮或抽吸填料的方式填裝於大型色譜柱中。

進行分離

有關選擇培養基、緩衝液、pH 值和離子強度條件以及方法優化的指南，請參閱 第 2 章。有關揮發性和非揮發性緩衝體系的建議，請參閱附錄2。

為了達到最佳的分離效果，避免色譜柱性能下降，正確的樣品和緩衝液準備是必不可少的。有關建議和意見，請參閱 第 2 章 和 附錄 1 。

過濾緩衝液時，應先加入所有鹽分和添加劑。使用高品質的水和化學品。通過 1 μM 過濾器過濾溶液。為避免填料柱中形成氣泡，請在運行前和運行期間將緩衝液和柱保持在恆溫狀態。

首次使用或長期存放後

1. 用 5 柱容量的蒸餾水清洗，流速 300 cm/h。
2. 使用 5 柱容量的洗脫緩衝液進行清洗，流速與步驟 1 相同。
3. 使用 5 柱容量的啟動緩衝液進行清洗，流速與步驟 1 相同。

梯度洗脱或阶梯洗脱

使用 Sepharose Big Beads 进行大规模纯化的条件将在方法开发期间确定，并与特定应用相关。有關優化分離的建議，請參閱第 2 章。典型的分離流速應為 200-500 cm/h。

如果使用了離子洗滌劑，用 5 柱容量的蒸餾水洗滌柱，然後用 2 柱容量的 2 M NaCl 洗滌柱。用至少 10 柱体积的起始缓冲液重新校准，直到 UV 基线、洗脱液 pH 值和/或电导率稳定为止。乙醇等有機溶劑可用於去除非離子洗滌劑。選擇有機溶劑時，請檢查介質的化學穩定性，以確定合適的濃度。

定期檢查色譜柱性能，確定色譜柱效率和峰對稱性。

請參閱附錄 3。

清潔

正確製備樣品和緩衝液，並在每次分離結束時進行高鹽分清洗（1 M NaCl），應能使大多數色谱柱保持良好狀態。然而，性能降低、流速緩慢、背壓增加或完全堵塞都表明介質需要使用更嚴格的程序進行清洗，以去除污染物。

建議在色譜柱清洗時顛倒流動方向，這樣污染物就不需要通過色譜柱的整個長度。每個清洗步驟所需的色譜柱容量和時間可能因污染程度而異。如果清除常見污染物的清潔步驟無法恢復色譜柱性能，請在嘗試其他清潔方法之前更換頂部過濾器（如可能）。

以下程序應能令人滿意地去除常見污染物

1. 以 40 cm/h 的速度用至少 2 柱容量的 2 M NaCl 溶液清洗，接觸時間為 1-2 小時。
2. 用至少 4 柱容量的 1 M NaOH（流量與步驟 1 相同）清洗。
3. 用至少 2 柱容量的 2 M NaCl（流量與步驟 1 相同）清洗。
4. 用至少 2 個柱容量的蒸餾水清洗（流量與步驟 1 相同），直到 UV 基線和洗出液 pH 穩定為止。
5. 用至少 4 個柱容量的啟動緩衝液或儲存緩衝液清洗（流量與步驟 1 相同），直到洗出液 pH 和電導率達到要求值。

要去除沉澱的蛋白質、脂質、疏水結合蛋白或脂蛋白，請參閱 附錄 1。

介質特性

組成：磺丙基（SP）或季氨基（Q）基團通過化學穩定的醚鍵耦合到高度交聯的 6% 琼脂糖上。

產品	pH穩定度*	平均粒徑
Q Sepharose Big Beads	-CHN+(CH3)3	長期：2-12 短期：2-14	200 μM
SP Sepharose Big Beads	-CH2CH2CH2SO3-	長期：4-13 短期：3-14	200 μM

* 長期 pH 穩定性是指培基在長時間內保持穩定而不會對色谱性能產生不良副作用的 pH 區間。
短期 pH 穩定性是指再生、原位清洗和消毒程序的 pH 區間。
所有範圍均基於 Cytiva 的經驗和知識估計。

化學穩定性

日常使用時，Sepharose Big Beads 媒介在所有常見的水性緩衝液、1 M NaOH、變性劑（8 M 尿素、6 M 鹽酸胍）、添加劑（如非離子洗滌劑）、70% 乙醇、1 M 乙酸、30% 乙腈和 30% 異丙醇中均保持穩定。

Sepharose Big Beads 可與有機溶劑一起使用，如二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、丙酮、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷和二氯乙烷/吡啶 (50:50) 以及極性溶劑和水/有機分離液。介質中的水可以被替代溶劑交換，而對基質的孔徑影響極小。

使用 SP Sepharose Big Beads 時避免陽離子洗滌劑。使用 Q Sepharose Big Beads 時避免使用陰離子洗滌劑。避免使用氧化劑。

儲存

色譜柱儲存時，先用 2 柱容量的蒸餾水洗，再用 2 柱容量的 20% 乙醇洗。在 SP Sepharose Big Beads 的儲存溶液中加入 0.2 M 醋酸鈉。對於小規模色譜柱，徹底對乙醇/水混合物進行脫氣；對於大規模色譜柱，確保在色譜柱之前加入空氣捕集器。以低流速添加儲存溶液，在色譜柱平衡時檢查背壓。或者，以中性 pH 保存在含 20% 乙醇的緩衝液中或 0.01 M NaOH 中。

室溫保存，或長期保存在 +4 °C 至 +8 °C。確保柱密封良好，避免乾燥。將未使用的培養基儲存於 20% 乙醇中，溫度為 +4 °C 至 +30 °C。請勿冷凍。