使用 Glutathione Sepharose^® High Performance、Glutathione Sepharose^® 4 Fast Flow 和 Glutathione Sepharose^® 4B 進行純化

這三種層析介質均用於純化 GST 標記重組蛋白和其他 S 轉移酶或谷胱甘肽依賴蛋白。它們可在溫和的洗脫條件下保留蛋白質的結構和功能。Appendix 2 (Characteristics of Glutathione Sepharose products) 了解所有 Glutathione Sepharose 介质的主要特性。

在 Glutathione Sepharose High Performance 中，谷胱甘肽配体与高度交联的 6% 琼脂糖偶联。

在 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 中，谷胱甘肽配体与高度交联的 4% 琼脂糖偶联。介質的平均珠子大小為 90 µM。由於其良好的結合能力和流動特性，是擴大規模的好選擇。

在 Glutathione Sepharose 4B 中，谷胱甘肽配体与 4% 琼脂糖偶联。介質的平均珠子大小為 90 µM。它具有非常高的結合能力，建議用於小規模純化以及批次和重力流操作。

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 和 Glutathione Sepharose 4B 也可預先包裝在 96 孔過濾板中。

GST 標記蛋白的批次和柱純化程序如下。

圖 5.3. Glutathione Sepharose High Performance、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 和 Glutathione Sepharose 4B 用於純化 GST 標記蛋白。

樣品製備

在開始本程序之前，請參閱 GST 標記蛋白質純化的一般注意事項。

根據結合緩衝液的成分和 pH 值調整樣品，方法包括從濃縮的儲備溶液中添加樣品；用結合緩衝液稀釋樣品；或進行緩衝液交換。

在使用樣品前，立即將樣品通過 0.22 µM 或 0.45 µM 過濾器和/或離心。如果樣本過於黏稠，可用結合緩衝液稀釋以防止堵塞；增加裂解處理（聲響處理、均質化）；或加入 DNase/RNase 以減少核酸片段的大小。

緩衝液的準備

使用高純度的水和化學品，並在使用前將所有緩衝液通過 0.45 µM 的過濾器過濾。

Binding buffer:	PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4），pH 7.3
洗滌緩衝液：	50 mM Tris-HCl，10 mM 還原型穀胱甘肽，pH 8.0

在結合緩衝液和洗脫緩衝液中可加入 1 到 20 mM DTT，以降低 GST 上游離 -SH 基團被氧化的風險，因為游離 -SH 基團可能會導致標記的目標蛋白聚集，從而降低 GST 標記蛋白的產率。

使用 Glutathione Sepharose HP、  Glutathione Sepharose 4 FF 或 Glutathione Sepharose 4B 批量純化 GST 標記蛋白

Glutathione Sepharose 色譜介質在 20% 乙醇中預先膨脹。

1. 確定您的純化所需的谷胱甘肽捨法糖的床面體積。
2. 使用移液管或量筒移取足夠的漿液，並轉移至適當的容器/試管中。
3. 以 500 × g 離心 5 分鐘，使層析介質沉澱。小心傾倒上清液。
4. 每 1 mL 漿液加入 5 mL PBS（=50% 漿液）清洗 Glutathione Sepharose HP、FF 或 4B。

谷胱甘肽 Sepharose 媒介必須用 PBS 徹底清洗，以去除乙醇儲存液，因為殘留的乙醇可能會干擾後續程序。

6. 以 500 × g 離心 5 分鐘，使層析介質沉澱。小心傾倒上清液。
7. 重複步驟 5 和 6 一次，共清洗兩次。

有關清洗、儲存和處理資訊，請參閱 Appendix 2 (Characteristics of Glutathione Sepharose products).

批量純化

1. 將細胞裂解液加入製備好的谷胱甘肽葡聚糖培養基，在室溫下培養至少 30 分鐘，使用輕柔的攪拌方式，例如端對端旋轉。
2. 使用移液管或量筒將混合物轉移到適當的容器/試管中。
3. 以 500 × g 離心 5 分鐘，沉澱培養基。小心傾倒上清液
   （= 飄逸）並保存用於 SDS-PAGE 分析，以檢查是否有未結合的目標蛋白質流失。
4. 每 1 mL 漿液加入 5 mL PBS（= 50%漿液）清洗谷胱甘肽 Sepharose 培養基。倒轉混合。
5. 以 500 × g 離心 5 分鐘，沉澱培養基。小心傾倒上清液（=洗滌），留作 SDS-PAGE 分析之用。
6. 重複步驟 4 和 5 兩次，共進行三次洗滌。
7. 每 1 mL Glutathione Sepharose 媒介漿液加入 0.5 mL 洗脱緩衝液，洗滌結合蛋白。在室溫下孵育 5 到 10 分鐘，使用輕柔的攪拌方式，例如端對端旋轉。
8. 以 500 × g 離心 5 分鐘，使介質沉澱。小心傾倒上清液（=洗離的蛋白質）並轉移到乾淨的試管中。
9. 重複步驟 7 和 8 兩次，共進行三次洗離。分別檢查三次洗出液中是否有純化的蛋白質，並將含有蛋白質的洗出液集中起來。

使用 Glutathione Sepharose HP、  Glutathione Sepharose 4 FF 或 Glutathione Sepharose 4B 柱純化 GST 標記蛋白

柱包裝

請參閱隨附的說明。p> 請參閱隨產品提供的說明，或參閱 Appendix 6 (Column packing and preparation)，以取得色譜柱包裝的一般指引。

製備

關於建議的流速，Appendix 6 (Column packing and preparation), Table A6.6。

1. 用約 5 柱容量的結合緩衝液平衡色譜柱。
2. 以低流速（約為洗滌和洗脫過程中流速的三分之一）使用預處理的樣品。
3. 使用 5 至 10 柱容量的結合緩衝液清洗色譜柱，直至流過液中沒有物質出現。保存流出液，用於 SDS-PAGE 分析，檢查是否有未結合的目標蛋白質流失。收集馏分并分别检查纯化的蛋白质。匯集含有 GST 標記目標蛋白的餾分。