cOmplete™ His-Tag 純化樹脂規範與疑難排解

His-Tag樹脂的步驟

產品編號COHISR-RO

FPLC 在原生條件下使用ÄKTAexplorer 100系統在原生條件下的FPLC純化

使用ÄKTAexplorer 100 System is available in the Instructions for Use of cOmplete His-Tag Purification Column (06781535001, 06781543001），請參閱Purification Protocols > Purification Under Native Conditions一章。

使用ÄKTAexplorer 100系統在變性條件下進行FPLC純化

使用ÄKTAexplorer 100系統進行自動快速蛋白質液相層析（FPLC）的詳細程序，請參閱cOmplete His-Tag Purification Column的使用說明（）。a href="/TW/zh/product/roche/cohiscro">06781535001、06781543001)，請參閱純化規範 > 變性條件下的純化章節。

色谱纯化协议

使用 cOmplete His-Tag 纯化树脂进行的纯化与各种一般纯化格式兼容，包括批处理、重力流柱纯化和使用自动色谱系统的自动处理。

FPLC應用的柱填料程序

cOmplete His-Tag Purification Resin以50%懸浮液的形式在20%乙醇中供應。

1. 倒置瓶子數次，將cOmplete His-Tag Purification Resin懸浮。
2. 用移液管將適量的樹脂轉移到色譜柱中，確保適配器或凝膠床中沒有氣泡殘留。
3. 讓樹脂沉澱。
4. 讓多餘的緩衝液通過重力流經色譜柱排出。
5. 將色谱柱連接到色譜系統/緩衝液儲存器。
6. 使用技術規格中所述的流速。

原生條件下的純化

原生蛋白質的純化應使用目標蛋白質的最佳緩衝條件。本文件中推薦的緩衝液是已建立的範例，可針對特定的目標蛋白進行調整，以達到最佳條件。
cOmplete His-Tag 純化樹脂在選擇最佳緩衝液條件時具有充分的靈活性，不會受到任何影響。
警告： cOmplete His-Tag Purification Resin 已使用下列緩衝液 A和緩衝液 B進行了優化。
缓冲液A： 50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0; 300 mM NaCl
緩衝液 B: 50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM imidazole

1. 用10柱体积的缓冲液A平衡色谱柱。
2. 上载含有His标记蛋白质的已清除样品（e.例如：在超速離心或過濾步驟之後）以2.5 mL/min（5 mL 樹脂床容積）或0.5-1 mL/min（1 mL 樹脂床容積）的容積流量加載到色譜柱上。警告：為防止樹脂堵塞，請在上柱前清除不溶性物質。 警告：由於樹脂的結合特異性很高，蛋白質與樹脂結合的動力學比其他可用樹脂慢。
3. 用缓冲液A清洗色谱柱，直到吸收（A₂₈₀）达到基线水平（大约10个色谱柱体积）。
4. 用緩衝液A（不含咪唑）和緩衝液B（250 mM咪唑）梯度洗滌His標記蛋白。警告： 蛋白峰可能在25到45 mM咪唑之間。由於cOmplete His-Tag Purification Resin的特殊性，蛋白已經可以用大約25 mM咪唑洗離。警告：洗脱缓冲液中有效释放树脂中的目标蛋白所需的咪唑量取决于各种参数：His-tag 的长度、His-tag 的可及性。
5. 為下一次運行進行清洗和平衡（參閱清洗步驟部分）。 警告：如果不立即重複使用純化柱，請用 2 柱容量的 2 M咪唑清洗柱子，以去除蛋白質的非特異性結合。在 20% 的乙醇溶液中平衡色譜柱，並儲存於 2-8 °C 以防止細胞生長。

注意：請參閱純化過程最佳化和疑難排解兩節，以獲得最佳化純化結果的技術建議。

變性條件下的純化

本文件中推薦的緩衝液是成熟的範例，可以進行調整以達到特定目標蛋白質的最佳條件。
將蛋白變性或將包涵體溶解在含有 6 M 胍-HCl 或 8 M 尿素的緩衝液中。
警告： 緩衝溶液中加入尿素會導致 pH 值下降。加入尿素後，必須用 NaOH 調整緩衝液的 pH。
警告： 如果緩衝液成分不理想，結合能力也可能大幅下降。
注意：為達到最佳效果，請進行隔夜孵育，以便更有效地將變性的目標蛋白結合到樹脂上。
Warning: cOmplete His-Tag Purification Resin 已使用下列緩衝液進行測試，因此可在這些緩衝液中發揮最佳功能。其他緩衝液也可能會起作用，需要在使用cOmplete His-Tag Purification Resin之前進行測試。
在變性條件下，準備下列緩衝液進行層析程序：
緩衝液 C： 100 mM NaH₂PO₄；10 mM Tris-HCl；8 M 脲；pH 8.0
緩衝液 D： 100 mM NaH₂PO₄；10 mM Tris-HCl；8 M 尿素；pH 6.3
緩衝液 E： 100 mM NaH₂PO₄；10 mM Tris-HCl；8 M 尿素；pH 5.9
緩衝液 F： 100 mM NaH₂PO₄；10 mM Tris-HCl；8 M 尿素；pH 4.5

1. 用 10 柱容量的缓冲液 C平衡色谱柱。
2. 將含有His標記蛋白質的清除樣品（例如，經過超速離心或過濾步驟）上柱，流速為0.5-1 mL/min，1 mL 树脂床体积。 警告：为防止树脂堵塞，请在装柱前除去不溶性物质。 警告：由于该树脂的结合特异性很高，蛋白质粘附到树脂上的动力学比其他可用树脂慢。因此，在蛋白上載步驟中，流速不要超過 1 mL/min。
3. 用缓冲液C清洗色谱柱，直到吸收（A280）达到基线水平（大约10到20个色谱柱体积）。
4. 用 10 至 20 柱容量的緩衝液 D洗柱。
5. 用 10 至 20 柱容量的緩衝液 E洗柱。
6. 用 10 至 20 柱容量的緩衝液 F靜置。
7. 在變性條件下，用緩衝液 C清洗和平衡下一次運行；如果下一次將在原生條件下使用色譜柱，則用緩衝液 A清洗以去除變性劑。警告：如果不立即重新使用色谱柱，请用两柱体积的 2 M 咪唑清洗色谱柱。在 20% 的乙醇溶液中平衡色譜柱，並儲存於 2-8 °C，以防止細胞生長。 注意：另外，也可以使用最高 250 mM 的咪唑溶液梯度進行洗脫，而不使用 pH 值轉移選項。

注意：請參閱純化過程優化和疑難排解兩節，以獲得優化純化結果的技術建議。

批次純化協議
批次純化協議可以在原生條件下進行，也可以在變性條件下進行。

1. 將適量的cOmplete His-Tag Purification Resin轉移到刻度容器或空柱中。
2. 用大約20柱容量的緩衝液A平衡含有樹脂的色譜柱。
3. 向製備好的樹脂漿中加入適量的清除裂解液。輕輕攪拌混合物，並將樹脂-淋洗液混合物在2-8 °C的搖床上培養2-12小時。
4. 用至少 5 柱体积的 A 缓冲液清洗色谱柱。
5. 用至少 5 個柱容量的 Buffer B 沖洗蛋白質。
6. 用 Buffer A 沖洗和平衡，以便下一次運行。警告：如果不立即重新使用色譜柱，請在20%乙醇溶液中平衡色譜柱，並保存在2-8 °C以防止細胞生長。

注意：請參閱純化過程最佳化和疑難排解兩節，以獲得最佳化純化結果的技術建議。

清洗步驟

完整的His-Tag純化樹脂可多次使用而不會失去結合能力。然而，隨著時間的推移，一些蛋白質聚集可能會導致樹脂效率降低。這可透過較慢的流速或較高的背壓加以識別。清洗程序可去除聚集物，進一步提高樹脂的使用效率。可根據樹脂的不同用途執行不同的清洗程序。

嚴格原生清洗

此方法適用於已純化非聚集蛋白，以及再次使用此柱純化相同蛋白質的情況。

• 用10個柱容量的1 M咪唑/HCl，pH 7.5洗柱，
• 用10個柱容量的4 M咪唑/HCl，pH 7.5洗柱，
• 用結合緩衝液平衡柱子，進行下一輪純化，或將材料轉移到20%乙醇中。

用 SDS 進行變性清洗

此方法適用於去除聚集蛋白和脂質。
警告：此清洗程序必須在 15-25 °C 下進行，因為 SDS 的溶解度在此溫度下比在 2 -8 °C 下更有效。
注意： SDS 緩衝液可能還含有 50 mM DTT。
警告：避免在此緩衝液中使用 K+，以防止 SDS 的沉澱。

• 用 10 柱容量的 1 M 咪唑/HCl，pH 7.5，
• 用10柱体积的1 M咪唑/HCl，pH 7.5，20%乙醇，2到4% SDS洗涤2次，
• 用3次10柱体积的20%乙醇去除SDS。

用 Guanidinium-HCl 進行變性清洗
此方法適用於去除聚集蛋白。
注意：胍基-HCl 緩衝液也可能含有 50 mM DTT。

• 用 10 支柱容量的 pH 7.5 的 1 M 咪唑/HCl 洗 2 次，
• 用 10 支柱容量的 pH 7.5 的 6 M 胍基-HCl、1 M 咪唑洗 2 次。5,
• 用 10 柱容量的 20% 乙醇清洗 2 次。

注意：一般而言，清洗方法的選擇取決於蛋白質類型。
註：使用胍基-HCl 的變性清洗程序比使用 SDS 的變性清洗方法受到的限制較少。

純化程序最佳化

允許最大蛋白質產量和純度的參數可能會因特定目標蛋白質的特性而有顯著差異。為了獲得最佳結果，請在小規模試驗純化過程中優化關鍵參數。要優化蛋白質純化程序以獲得最高的蛋白質純度，需要確定樹脂對特定目標蛋白質的最佳操作條件。蛋白製備的純度和產率都取決於用於結合的 cOmplete His-Tag 純化樹脂的用量。如果樹脂用量相對於可用的目標蛋白用量過高，樹脂上剩餘的結合位點可能會與裂解液成分產生背景結合。如果樹脂用量太少，樹脂的結合能力可能不足以結合所有目標蛋白，這將導致蛋白產率不達到最佳。當基質的容量與目標蛋白的數量相匹配時，就能得到最佳的結果。特定目標蛋白的容量取決於幾個因素，如目標蛋白的大小、構象和多聚化狀態、His-標記的長度和可及性、His-標記蛋白的表達水平和可溶性、裂解液濃度以及緩衝液的 pH 值和組成。為達到最佳效果，請確定純化特定相關蛋白所需的最佳樹脂用量。根據蛋白質的表達率和可用的裂解液體積，通過進行以下預試來確定樹脂的最佳用量：

• 在平行測試實驗中，將少量沉澱的樹脂與不同容量的裂解液培養，
• 清洗樹脂並洗離結合的蛋白質，
• 當只有少量目標蛋白留在流過液中，而在洗出液餾分中檢測到最大蛋白量時，裂解液量/樹脂量的比例是最佳的。

例如，纯化 20 到 40 mg T7 RNA 聚合酶 (97 kDa)，所需的树脂量为 1 mL。
注意：目标蛋白的产率可以通过让蛋白有更多的时间与树脂结合来优化。這可以通過在層析純化的加載步驟中降低流速來實現。另外，在不影響蛋白質完整性的情況下，可以在批次純化程序中進行長達 12 小時的批次吸附。例如，在批次純化程序中，將蛋白質溶液與 cOmplete His-Tag Purification Resin 在管中、滾筒上不同的孵育時間後，測量 His6-tagged T4 基因 32 蛋白質的吸附情況。
註：在結合、洗滌和洗脫步驟中，咪唑的最佳濃度也可以在固定等分樹脂的預試實驗中確定。
註：對於與這些條件相容的目標蛋白質，通常可使用 pH 8.0、含高鹽濃度（300 mM）的緩衝液達到最佳結果。

疑難排解

問題；可能原因；建議

床層樹脂中形成氣泡：

• 儲存緩衝液（20% 乙醇）與水性緩衝液混合； a) 在 2-8 °C 儲存後，將色谱柱平衡至 15-25 °C。b) 在平衡色譜柱前對緩衝液進行脫氣。

樣品不容易流過色譜柱（低流速或高背壓）：

• 裂解液中的微粒可能堵塞了色譜柱；a) 在上柱前離心或超速離心樣品。

目標蛋白與柱內樹脂的結合不充分：

• 結合步驟中緩衝條件不理想；結合步驟中降低咪唑濃度和/或增加 pH 值。
• 孵育時間太短；a) 延長孵育時間。b) 在結合過程中降低流速。
• 無法接觸到 His-tag；a) 改變 His-tag 的位置。

目标蛋白洗脱不充分或无法洗脱：

• 目标蛋白多聚化，与树脂结合更紧密；提高洗脱过程中的咪唑浓度。
• 蛋白在洗脱前沉淀在树脂上；a) 增加离子强度以减少等电点沉淀。

目標蛋白的回收率太低：

• 目標蛋白可能被降解；a) 如果在細胞裂解過程中發生降解，請在樣品中加入蛋白酶抑制劑。b) 蛋白降解也可以通過在2-8 °C下工作來預防。
  
• His-tag可能無法被訪問； a) 使用更長的His-tag。d) 改變 His-tag 的定位。
• His-tag 可能已被蛋白酶消化；a) 改用其他表達宿主。b) 使用蛋白酶抑制劑。
• 目標蛋白可能不溶解；a) 降低表達溫度、強度和誘導持續時間。b) 在變性條件下進行純化。 c) 加入溶解度增強的融合夥伴。
• 樹脂是有限制的；驗證表達的 His-tagged 蛋白與柱內的樹脂是否成比例。

目標蛋白與污染物一起洗出：

• 宿主蛋白與樹脂相互作用；a) 在上載和洗滌步驟中，通過增加咪唑濃度/降低 pH 值來增加嚴格性。b) 增加樣品量。c) 用嚴格的緩衝液清洗色譜柱。
• DNA和/或RNA污染物；a) 在變性條件下進行純化。b) 將裂解液加入色譜柱前，加入DNase I消化步驟和/或Polymin P介導的沉澱步驟。

目標蛋白在細胞裂解過程中或裂解後被降解：

• 蛋白酶保護不足；a) 在緩衝液和/或培養液中加入蛋白酶抑制劑。c) 嚴格在冰上工作。
  

目標蛋白在宿主細胞中降解：

• a)使用蛋白酶缺乏的宿主菌株。