超氧化物歧化酶的酵素分析

1. 目的

標準化超氧化物歧化酶的酵素測定程序。

2. 範圍

本程序適用於所有以酵素測定超氧化物歧化酶活性規格的產品。

3.定義

• 純淨水：來自去離子系統的水，電阻率 > 或 = 18MΩ-cm @ 25 ºC
• 單位定義：在耦合系統中，使用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶，在 pH 7.8、25 °C、3.0 mL 反應容量下，一個單位可抑制細胞色素 c 還原率 50%。黃嘌呤氧化酶濃度應每分鐘產生 0.025 +/- 0.005 的初始（未抑制）ΔA_550nm 。
• XOD - 黃嘌呤氧化酶
• SOD - 超氧化物歧化酶。
• O2^¯∙ - 超氧自由基

4.討論

超氧自由基是由黃嘌呤氧化酶催化反應酵素化產生的：
黃嘌呤 + O₂ + H₂O    XOD   > Uric acid + O₂^¯∙ + H⁺

氧化的細胞色素 c 被超氧自由基還原。還原速率在 550 nm 下用分光光度法跟蹤：
細胞色素³⁺ c + O₂^¯∙      > Cytochrome²⁺ c + O₂

c 的還原：
2 O₂^¯∙ + 2 H^{+    ；SOD}   > O₂ + H₂O₂

5.責任

分析服務實驗室人員應按照書面規定遵守本程序.

6.安全

請參閱材料安全資料表 (MSDS)，瞭解危害和適當的處理預防措施。

7.程序

7.1條件：T = 25 °C，pH = 7.8，A_550nm，光路 = 1 cm

7.2 方法：連續 分光光度法速率測定

7.3 試劑：

7.3.1    216 mM 磷酸鉀緩衝液，pH 7.8，25 °C（緩衝液）：製備 49.3mg/mL 磷酸二氢钾三水合物（產品編號 P5504）在純淨水中的溶液。  在 25 °C 下，用 1 M KOH 或 1 M HCl 將 pH 調至 7.8。

7.3.2    10.7 mM 乙二胺四乙酸溶液（EDTA）：  配製 4.0 mg/mL 的乙二胺四乙酸二鈉二水溶液（產品編號：No.

7.3.3    1.1 mM 细胞色素 C 溶液 (Cyt C)：在純淨水中製備 14.6 mg/mL 的細胞色素 C 溶液（產品編號 C7752）。

7.3.4    0.108 mM Xanthine Solution (Xanthine): Dissolve 1.64 mg Xanthine (Product No. X0626)於 90 mL 純水中。在攪拌下，加入少量 1 N KOH，直到全部黃嘌呤溶解。定量地將溶液轉移到 100 mL 容量瓶中，並用純水加至 100 mL。

7.3.5    Xanthine Oxidase Enzyme Solution (XOD)：在冷純水中製備含有約 5 單位/毫升黃嘌呤氧化酶（產品編號X1875）的溶液。

7.3.6   在化驗中使用前，立即使用試劑 XOD 在冷純水中製備含 0.05 單位/毫升黃嘌呤氧化酶的溶液。此濃度可能需要調整以符合第 7.4.3 節的要求。

7.3.7    超氧化物歧化酶酵素溶液：

7.4 分析程序

7.4.1  用移液管  將下列試劑  (以毫升為單位)移入適當的容器中，製備反應雞尾酒：

7.4.2  用移液管  將下列試劑  (以毫升為單位)移入適當的容器中，製備反應雞尾酒：

Purified Water	23.0
試劑 7.3.1 (緩衝液)	25.0
Reagent 7.3.2 (EDTA)	1.0
Reagent 7.3.3 (CytoC)	1.0
Reagent 7.3.4 (Xanthine)	50.0

7.4.2    必要時用 1 M HCl 或 1 M KOH 在 25 ℃ 下混合並調整 pH 至 7.8。

7.4.3    黃嘌呤氧化酶檢查：

7.4.3.1    用移液管移取下列物質（以毫升計）到適當的比色皿中：

	空白	XOD
Reagent 7.4.2 (雞尾酒)	2.80	2.80

7.4.3.2   使用適當恆溫的分光光度計平衡至 25 °C。監測 550 nm 處的吸光度，直至恒定，然後再加入：

Purified Water	0．20	0.10
試劑 7．2 (XOD)	-----	0.10

7.4.3.3  反轉混合，在 550 nm 處記錄吸光度的增加，約 5 分鐘。對於此反應，未抑制與空白的吸光度變化應為 0.025+/-0.005。如果不是，請調整試劑 7.3.6 的濃度，並重複第 7.4.3 節。

7.4.4   移取（以毫升為單位）下列試劑至適當的比色管中：

7.4.4   移取（以毫升為單位）下列試劑至適當的比色管中：

	空白	未抑制	測試-1	測試-2	測試-3
Reagent 7.4.2 (雞尾酒)	2.80	2.80	2.80	2.80	2.80
純淨水	0.20	0.10	-----	0.01	0。02
Reagent 7.3.6 (SOD)	-----	-----	0.10	0.09	0.08

7.4.5    使用適當恆溫的分光光度計平衡至 25 °C。在 550 nm 處監測吸光度直至恒定，然後加入：

Reagent 7．2 (XOD)	-----	0.10	0.10	0.10	0.10

7.4.6    倒置混合，在 550 nm 處記錄吸光度的增加，持續約 5 分鐘。獲得未抑制反應在一分鐘間隔內的最快線性速率。

7.4.7   每項抑制測試的ΔA_550nm 應在未抑制速率的 40-60% 以內。任何超出此範圍的值都被視為無效。

7.5 計算

7．1	(ΔA550nm/min 未抑制 - ΔA550nm/min 抑制)(100)
		(ΔA550nm/min未抑制 - ΔA550nm/min空白)

	單位/毫升酵素：	(Percent Inhibition)(DF)
		(50%)(0.10)

DF = 稀釋因子
    50% = 根據單位定義抑制細胞色素 c 還原速率
    0.10 = 每次試驗中使用的酶的體積（毫升）

7.6 最終測試濃度 :
在 3 mL 反應中，最終濃度為 50 mM 磷酸鉀、0.1 mM 乙二胺四乙酸、0.01 mM 細胞色素 c、0.05 mM 黃嘌呤、0.005 單位黃嘌呤氧化酶和 1 單位超氧化物歧化酶

。

材料

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