溶菌酶的酶学测定（EC 3.2.1.17）

描述

本程序步骤可用于溶菌酶产物的酶学测定。分光光度速率测定（A₄₅₀，光程 = 1 cm）基于以下反应：

                                                                                      Lysozyme

溶壁微球菌细胞（完整）  ––––––––>  溶壁微球菌细胞（已溶解）

单位定义 — 一个单位的溶菌酶在pH6.24、25℃下，使用溶壁微球菌悬液作为底物，在2.6 mL反应混合物中每分钟产生0.001 ΔA₄₅₀。

所需试剂和设备

1.0 M磷酸氢钾溶液（P8709）

1.0 M磷酸氢二钾溶液（P8584）

1 M 氢氧化钾（KOH）溶液

1 M HCl溶液

溶壁微球菌，ATCC号4698，冻干细胞（M3770）

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。

缓冲液（50 mM磷酸钾缓冲液，pH 6.24，25°C）— 制备550 mL：

• 加入20.125 mL的1.0 M磷酸氢钾溶液（P8709）。
• 加入7.375 mL的1.0 M磷酸氢二钾溶液（P8584）。
• 加入超纯水，最终定容为550 mL。
• 使用1 M KOH或1 M HCl在25°C下将pH调节至6.24。

底物悬液（0.015％ [w/v] 溶壁微球菌细胞悬液）— 使用溶壁微球菌，ATCC号4698，冻干细胞（M3770）在缓冲液中制备0.15mg/mL悬液。

底物适用性：该悬液的A₄₅₀必须介于0.6-0.7之间，而不是缓冲液空白。如有必要，使用适量的缓冲液或溶壁微球菌细胞调整吸光度。

酶溶液（溶菌酶） — 在使用前，立即在冷的（2-8℃）缓冲液中制备含有200-400单位/mL溶菌酶的溶液。

操作流程

1.将以下试剂移液到合适的比色皿中并平衡至25 °C，使用适当恒温的分光光度计：

试剂	空白样(ml)	检测1（mL）	检测2（mL）	检测3（mL）
底物悬液	2.50	2.50	2.50	2.50

2.然后添加：

试剂	空白样(ml)	检测1（mL）	检测2（mL）	检测3（mL）
缓冲液	0.10	–	–	–
酶溶液	–	0.10	0.10	0.10

3.立即颠倒混匀并记录A₄₅₀的下降~5分钟。获得所有测试和空白样的最大线性速率（ΔA₄₅₀/分钟），使用至少一分钟的时间间隔和最少4个数据点。

结果

计算

1.

式中：

df =稀释因子

0.001 = 单位定义中的吸光度（ΔA450）变化

0.1 = 酶溶液的体积（以毫升计） 

2.      

材料

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参考文献

1. Shugar D. 1952. The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet inactivation of lysozyme. Biochimica et Biophysica Acta. 8302-309. https://doi.org/10.1016/0006-3002(52)90045-0

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