DNase I 重組、無 RNase 協定

Product No. 04716728001

從 RT-PCR 反應中去除 DNA：

Overview

來自牛胰腺的DNase I是一種Mr 37000的糖蛋白。使用特殊的程序來去除 DNase 製劑中的 RNases。DNase I 是一種 DNA 特異性內切酶，可將 ds 或 ssDNA 水解為寡核苷酸和單核苷酸的混合物。這種酵素需要二價陽離子才能產生最大活性。反應的特異性取決於陽離子的性質。在 Mg²⁺  的存在下，DNase I 會造成 dsDNA 的缺口，而在 Mn²⁺  的存在下，酵素會產生雙鏈斷裂。

RT-PCR去除DNA的建議方法

10 x 反應緩衝液：200 mM Tris-HCl, pH 8.3 500 mM KCl 10 mM MnCl₂ 建議加入20 U Protector RNase Inhibitor;
每1 μg總RNA加入1 U DNase I, RNase-free，+25 ℃孵育30 min。

通過酚/氯仿萃取和隨後的乙醇沉澱來停止反應（或者，在 +75 °C 下加熱 5 分鐘來停止反應，但要注意溫度升高會損壞 RNA）。

注意：one-tube RT-PCR

移除 Mn²⁺ 緩衝液和酵素是必要的，以避免使用 Titan-One-Tube RT-PCR 系統進行一步 RT-PCR 時受到干擾。在這種情況下，可以使用另一種方法：

1. 將 1 μg RNA 溶解在 40 mM Tris, pH 8, 10 mM MgSO₄, 1mM CaCl₂
2. 加入 6 U DNase I, RNase-free 和 20 U Protector RNAse Inhibitor。
3. 在 +37 °C下孵育 1 小時

在 +90 °C下活化 5 分鐘，短暫離心並馬上冰上孵育

。

材料

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