GST標記蛋白質是通過將一個基因或基因片段插入到13個pGEX載體之一的MCS中來構建的。其表達受 tac 促動子控制，並由乳糖類似物異丙基 β-D-thiogalactoside (IPTG) 誘導。所有的 pGEX 載體都有一個內部的 lacIq 基因。lacIq 基因產物是一種抑制蛋白，它能與 tac啟動子的運算子區域結合，在 IPTG 誘導之前阻止其表達，從而保持對插入物表達的嚴格控制。
其中九種載體具有包含六個限制位點的擴展 MCS。pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3各自編碼了GST結構域和MCS之間的PreScission Protease進行位點特異性裂解的識別序列。pGEX-5X-1、pGEX-5X-2 和 pGEX-5X-3 是 pGEX-3X 的衍生物，具有 Xa 因子識別位點（表 1.1）。
pGEX-2TK的MCS與其他載體不同。pGEX-2TK的設計目的是通過在體外直接標記被標記的產物來檢測所表達的蛋白質。此載體包含從心肌取得的 cAMP 依賴性蛋白激酶催化亞基的辨識序列。蛋白激酶位點位於凝血酶識別位點和 MCS 之間。pGEX-2TK是pGEX-2T的衍生物，其標記蛋白可被凝血酶裂解。
總體而言，pGEX 向量提供了從 EcoRI 限制位點開始的所有三個轉譯閱讀框 (圖 1.1)。pGEX-1λT、pGEX-6P-1、pGEX-4T-1和pGEX-5X-1可以直接接受和表達從λgt11文庫中分離出來的cDNA插入片段。
參考附錄 2 (pGEX載體的控制區域），以取得pGEX載體控制區域的清單。完整的 DNA 序列和限制位點資料可從 GenBank™ 獲得。GenBank 登錄編號列於附錄 2 (pGEX 載體的控制區域).
。
圖 1.1.顯示讀取框和主要特徵的 GST 向量地圖。所有 13 個載體在 MCS 下游的三個閱讀框中都有停止編碼子 (此圖中未描繪)。請參閱附錄 2 (pGEX載體的控制區域)，以瞭解13種載體的控制區域。
選擇適當的載體以匹配克隆插入物的閱讀框。
考慮哪種蛋白酶和裂解條件最適合您的目標蛋白製備。
pGEX-6P PreScission Protease 載體提供了最有效的裂解和純化 GST 標記蛋白的方法。位點特異性裂解與蛋白酶同時固定在色譜柱上。蛋白酶在低溫下具有高活性，因此所有步驟均可在冷室中進行，以保護目標蛋白的完整性。裂解酵素與 GST 標籤可在單一步驟中移除。
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？