準備電穿孔細胞

細胞電穿孔法是一種利用電場增加細胞膜通透性的方法，以便將 DNA 或其他物質導入細胞中。

細胞電穿孔法的試劑製備

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表 1.所需試劑

在 900 mL 蒸餾水中溶解 16 g 胰蛋白胨、10 g 酵母抽提物和 5 g NaCl。用 NaOH 調整 pH 至 7.0。用蒸餾水將容量調至 1 L。高壓滅菌 20 分鐘。若要製作固體培養基，加入 1.2% 至 1.5% 的瓊脂。
1 mM HEPES：	0.26 g HEPES，鈉鹽。溶於 900 mL 蒸餾水中。將 pH 調至 7.0。用蒸餾水調整容積至 1 L。
10% glycerol in 1 mM HEPES, pH 7.0:	無菌添加 10 mL 100% 甘油至 90 mL 1 mM HEPES，pH 7.0。
將 10 mL 100% 甘油加入 90 mL 蒸餾水中。
10 mM Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTA
Phenol：	氯仿/异戊醇：	試劑級氯仿和異戊醇，混合 24：
等份的再蒸餾苯酚和氯仿/異戊醇（24：1），各按上述方法製備
3 M 醋酸鈉，pH 5.4，水溶液 乙醇，70%，95%

Procedure

1. 將 10 mL 2× YT 培養基接種於來自 LB 或 2× YT 培養基平板的 大腸桿菌 宿主菌株。在 37 °C 下震盪培養過夜。
   
   
2. 接種 1 L 2× YT 培養基與宿主細胞過夜培養物的 10 mL 。在 37 °C 下孵育 2 至 2.5 h，以 250 rpm 搖動，直到 A₆₀₀ 達到 0.5 至 0.7。
   
   
3. 將燒瓶放在冰上 15 至 30 分鐘。
   
   
4. 在 4 °C 下以 4,000 × g 脫水 20 分鐘。
   
   
5. 濾去上清液，將細胞重懸於 1 L 冰冷無菌 1 mM HEPES，pH 7.0.
   
   
6. 如上所述旋轉。傾去上清液，將細胞重懸於 500 mL of ice-cold sterile 1 mM HEPES, pH 7.0.
   
   
7. 如上所述旋轉。將上清液倒掉。用 20 mL of sterile 1 mM HEPES, pH 7.0, containing 10% glycerol.
   
   
8. 如上所述旋轉細胞。將上清液倒掉。
   
   
9. 將細胞重懸於總容量為 2 至 3 mL  的蒸餾水中的無菌 10% 甘油中。
   
   
10. 以 50 至 100 µL 等分的方式分離，並進行電穿孔處理，或冷凍於乾冰上並儲存於 -70 °C。
    
    
11. 用等体积的苯酚/氯仿和等体积的氯仿/异戊醇提取连接的 pGEX 载体（以及未切割的载体）各一次。
    
    
12. 移去水相，加入 1/10 μL 3 M 醋酸鈉，pH 5.4 和 2.5 μL 95% 乙醇。
    
    
13. 放置在乾冰上 15 分鐘，然後在微離心機中旋轉 5 分鐘，將 DNA 壓團。
    
    
14. 移除上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗滌壓團。離心 5 分鐘，棄去上清液，並烘乾膠粒。
    
    
15. 將每個 DNA 膠粒重懸於 20 µL 無菌蒸餾水中。另外，也可以用凝膠帶純化 DNA。

    注意：DNA 在電穿孔前必須完全不含鹽。

電穿孔效率

建議在進行插入/pGEX連接時，同時轉換一奈米未切割（超卷曲）的載體 DNA，以確定每個合格細胞製備的效率。關於電穿孔協議的更多資訊，請參閱所選電穿孔系統的使用說明。

材料

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