人類成骨細胞 (HOb) 培養規範

• 培養前準備<
• 次培養 HOb<
  
• Differentiating HOb
• 材料材料

I.儲存

A.冷凍保存的小瓶 (406-05a, 406-05f)

冷凍小瓶運抵後，請立即存放於液氮儲存槽中。

*從液氮儲存槽中取出冷凍小瓶時，請務必戴上面罩和手套。從儲存槽到室內的劇烈溫度變化可能導致冷凍瓶中滯留的液氮爆裂並造成傷害。

人類成骨細胞 (HOb)

II.培養前的準備

1. 確保具有 HEPA 過濾層流空氣的 Class II 生物安全櫃處於正常工作狀態。
2. 用 70% 酒精消毒生物安全櫃。
3. 開始細胞培養工作前，將生物安全櫃的鼓風機打開 10 分鐘。
4. 確保所有血清移液器、移液器吸頭和試劑溶液均為無菌。
5. 遵循標準的消毒技術和安全規則：
   a. 不要用嘴移液。請勿用口移液。
   b．使用人類細胞時，即使所有菌株都已
       經過 HIV、乙型肝炎和丙型肝炎測試呈陰性反應，也一定要戴手套和安全眼鏡。在無菌罩中處理所有細胞培養工作。

III.培養 HOb

A.準備培養 HOb 的細胞培養瓶

1. 從冰箱中取出人類成骨細胞生長培養基 (417-500)。
2. 用移液管吸取 15 mL 人類成骨細胞生長培養基 (417-500)* 到 T-75 燒瓶 (SIAL0641)中。
   * 保持培養基與表面面積的比例為每 5 cm² 1mL。
   例如：
   -  5 mL 用于 T-25 烧瓶 (SIAL0639) 或 60 mm 组织培养皿 (SIAL0166)。
   -  15 mL 用於 T-75 燒瓶  (SIAL0641) 或 100 mm 組織培養皿  (SIAL0167).

B.解凍和接種 HOb

1. 使用適當的眼睛和手部保護措施，從液氮儲存槽中取出低溫保存的 HOb 瓶。
2. 將小瓶蓋轉動四分之一圈，以釋放可能滯留在螺紋中的液氮，然後將蓋子重新鎖緊。
3. 將小瓶的下半部放入 37 °C 水浴中快速解凍細胞，並在解凍過程中密切觀察小瓶。
4. 當小瓶中只剩下少量冰時，從水浴中取出小瓶。不要讓細胞完全解凍。
5. 用 2 mL 移液管輕輕地移動細胞 5 次，重悬小瓶中的細胞。
6. 將小瓶中的細胞懸液（1mL）移入盛有15 mL人骨細胞生長培養基（417-500）的T-75容量瓶（SIAL0641）中。
7. 蓋上瓶蓋，輕輕搖動，使細胞均勻分佈。
8. 將T-75燒瓶(SIAL0641)置於37 °C，5% CO₂ 加濕培養箱中。鬆開瓶蓋以進行氣體交換。
9. 24小時後或隔夜換上新鮮的人類成骨細胞生長培養基(417-500)，以去除所有DMSO的痕跡。
10. 隔天換一次人類成骨細胞生長培養基(417-500)，直到細胞達到60%的融合度。
11. 當培養達到 >60% 匯合或週末餵養時，加倍 Human Osteoblast Growth Medium (417-500)的用量。
12. 當 HOb 培養達到 80% 匯合時，對細胞進行分培。

IV.亞培養 HOb

A.Preparing Subculture Reagents

1. 從-20 °C的冷凍庫中取出 胰蛋白酶-EDTA溶液 (T3924)和 胰蛋白酶抑制劑 (T6414)，並在冰箱中解凍過夜。
2. 確保所有亞培養試劑均已解凍。輕輕攪拌每瓶試劑數次，以形成均勻的溶液。
3. 將所有亞培養試劑儲存於 4 °C，以備日後使用。
4. 如果只需要一部分 胰蛋白酶/EDTA溶液 (T3924)，請將未使用的部分儲存於-20 °C。準備培養瓶
   1. 從冰箱中取出 人骨細胞生長培養基 (417-500)。
   2. 用移液管移取30 mL人類成骨細胞生長培養基 (417-500)至T-175燒瓶 (SIAL1080)中（將用於第四節C步驟15）

   C.在室溫下胰蛋白酶化細胞。

5. 用 HBSS (H6648)清洗單層細胞，並吸去溶液。
6. 用移液管吸取 6 mL 胰酶/EDTA 溶液(T3924)到 T-75 烧瓶(SIAL0641)中。
7. 立即移除 5 mL 溶液。
8. 重新蓋緊瓶蓋，在室溫下於倒置顯微鏡下觀察胰蛋白酶化的進度。細胞變圓通常需要 2 到 4 分鐘。在胰蛋白酶化過程中，細胞可能不會完全變圓，有些細胞即使從培養基表面鬆脫，仍可能保持一定的過程。
9. 用手掌敲打瓶側，直到大部分細胞脫離，從培養基表面釋放圓形細胞。
10. 用移液管移取5 mL胰蛋白酶抑制劑溶液(T6414)到瓶中，以抑制進一步的胰蛋白酶活性。
11. 將培養瓶中的細胞懸浮液轉移到 50 mL 無菌錐形管中。
12. 用另外 5 mL 的 胰蛋白酶抑制溶液 (T6414)冲洗烧瓶，并将溶液转移到同一锥形管中。
13. 在显微镜下检查 T-75 烧瓶 (SIAL0641)。
14. 將錐形管以 220 x g 離心 5 分鐘，使細胞沉澱。
15. 噴出管中的上清液，不要打亂細胞沉澱。
16. 用手指輕彈圓錐管的頂端，鬆開細胞團。
17. 將細胞重懸在 5 mL 人骨細胞生長培養基（417-500）中，用移液器輕輕地移動細胞，使其團塊破裂。快速生長時接種 10,000 cells per cm² ，定期分次培養時接種 5,000 cells per cm² 。

V.分化 HOb

A.接種 HOb 以進行分化

1. 將所需格式的 HOb 以 10,000 個/cm² 接種在人類成骨細胞生長培養基 (417-500)中。
2. 將細胞置於 37 °C、5% CO₂ 加濕培養箱中。
3. 第二天換成 人骨母細胞分化培養基 (417D-250)，方法是從培養組織器皿中抽出生長培養基，加入適當容量的 人骨母細胞分化培養基 (417D-250)。
4. 將細胞培養在37 °C，5% CO₂ 加濕的培養箱中。

B。體外礦化

1. 從培養組織器皿中吸出 人骨細胞分化培養基 (417D-250)。
2. 加入適當容量的 人骨細胞分化培養基 (417D-250)。
3. 將細胞培養在37 °C，5% CO₂ 加濕培養箱中的 人骨細胞分化培養基 (417D-250)中。
4. 隔天更換新鮮的 人類成骨細胞分化培養基 (417D-250)。
5. 10-14天後會分泌致密的細胞外基質並形成礦化結構。

材料

抱歉，發生意外錯誤。

Network error: Failed to fetch