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首頁單分子計數 (SMC®) 技術阿茲海默症生物標誌物的多重免疫分析法

阿茲海默症生物標誌物的多重免疫分析法

對於複雜的神經退行性疾病，如阿爾茨海默病，整合多重和高靈敏度免疫分析來檢測生物標誌物，可以幫助研究人員更好地了解疾病機制。請繼續閱讀，了解這個概念如何應用於 MILLIPLEX® 多重和 SMC® 高靈敏度免疫分析檢測人類腦脊液、血漿和血清樣本中的阿爾茨海默病生物標誌物。

 

為什麼要在 AD 研究中結合多重和高靈敏度免疫分析？

監測阿爾茨海默病（AD）患者樣本的腦脊液（CSF）中的蛋白質生物標誌物對了解疾病進程非常有益1。多重免疫分析讓研究人員能夠同時測量多種生物標誌物，並從單一實驗中產生大量可靠的資料。

對於以血液為基礎的 AD 生物標誌物的需求，促使研究人員不斷尋找新的候選 2。然而，基於血液的生物標誌物的鑑定可能會受到標準免疫分析方法靈敏度的限制。高靈敏度免疫分析技術可以測量各種生物流體中的低豐度蛋白質，從而改變神經退行性疾病的研究，並為鑑定新型生物標誌物3,4創造機會。


如何在高靈敏度免疫分析中使用多重免疫分析

為了展現單分子計數 (SMC®）技術在不同樣本類型中量化阿爾茨海默病生物標誌物的超靈敏能力，我們使用來自 AD 患者和健康對照組的 CSF、血漿和血清評估了市售的 MILLIPLEX®神經科學試劑盒。

人體 CSF、血漿和血清來自 AD 患者和非 AD 對照組 (正常)，經由商業供應商 (Discovery Life Sciences、BioIVT 和 PrecisionMed) 取得。樣本依據試劑盒規範進行純化或稀釋。

MILLIPLEX®多重分析根據產品說明書在96孔板中進行。在 Luminex® 200™ 系統上測量平均螢光強度 (MFI)，並使用 MILLIPLEX® Analyst 5.1 軟體分析資料。

使用了以下多重分析：

  • MILLIPLEX®人淀粉樣β和Tau Panel（Cat.HNABTMAG-68K）來定量分析：淀粉样蛋白 β (1-40) (Aβ40)、淀粉样蛋白 β (1-42) (Aβ42)、总 Tau (tTau) 和 1:2 稀释 CSF 样品中的 pTau T181。
  • MILLIPLEX® Human Neuroscience Panel 1 (Cat.HNS1MAG-95K）用於定量分析整齊 CSF 樣本中的分析物質：α-突觸核蛋白、膠質纖維酸性蛋白 (GFAP)、神經元特异性酵素酶 (NSE)、PARK5 (UCHL1)、PARK7 (DJ-1) 和 Transglutaminase 2 (TGM2)。
  • MILLIPLEX® Human Neuroscience Panel 2 (Cat.No.HNS2MAG-95K）來定量分析物質：血管生成素 (ANG)、ApoE4、FABP3、鐵質蛋白、神經粒蛋白 (NGRN) 和 TREM2。本試劑組已通過 CSF 和血液（血清和血漿）樣本的驗證

SMC® 淀粉樣蛋白 Beta 1-40 高靈敏度免疫分析試劑盒（Cat.03-0145-00）和 SMC® Amyloid Beta 1-42 高靈敏度免疫分析試劑盒（Cat.No.03-0146-00），按照產品說明書對淀粉樣β肽進行定量。使用兩台儀器獨立定量 SMC® 免疫分析：ERENNA® 和 SMCxPRO® 儀器。Sgx Link™ 和 xPRO® 軟體分別用於 ERENNA® 和 SMCxPRO® 平台的資料收集和分析。

 

多工結果

®多重免疫分析被公認為測量神經退行性疾病生物標誌物的重要工具。

CSF樣本

在評估血清和血漿樣本中的生物標誌物檢測之前，先在正常人和AD患者的CSF樣本中檢測了幾種已確立和新出現的神經退行性疾病生物標誌物。使用的每種試劑盒的標準曲線如圖 1 所示。

用於神經科學研究的多重免疫分析。圖示為 MILLIPLEX® (A) 人類淀粉樣蛋白 Beta 和 Tau 試劑盒、(B) 人類神經科學面板 1 和 (C) 人類神經科學面板 2 標準曲線的 MFI 值。

圖 1.用於神經科學研究的多重免疫分析。所示為 MILLIPLEX® (A) 人類淀粉樣蛋白 Beta 和 Tau 試劑盒、(B) 人類神經科學面板 1 和 (C) 人類神經科學面板 2 的標準曲線。

使用多重試劑盒評估AD患者和健康對照組（正常）的CSF樣本，並測定特定生物標記物濃度的差異。與對照樣本相比，每種試劑盒都揭示了 AD CSF 中的變化（圖 2）。

MILLIPLEX® 對正常和 AD CSF 樣本進行多重生物標記分析，包括 pTau181、NSE、Neurogranin、Aβ42 和 GFAP。

圖 2. 正常和 AD CSF 樣本的多重生物標記分析。

使用MILLIPLEX®神經科學試劑盒測量人體CSF中的16種蛋白質。使用這些試劑盒分析正常和 AD CSF 樣本，發現磷酸化 Tau (p=0.0009)、Aβ42 (p=0.0476)、NSE (p=0.008)、GFAP (p=0.0016)、UCHL1 (p=0.0088, 資料未顯示) 和 Neurogranin (p=0.0359) 有差異。

對於每種試劑盒，樣本大小如下：

  • 人類淀粉樣 Beta 和 Tau Panel - 正常 CSF（n=14）和 AD CSF（n=16）

在人類淀粉樣β和Tau面板中，AD CSF中的β42減少了，而磷酸化Tau (Thr181)增加了，這與這些典型AD生物標誌物5的既定觀察結果一致。在 AD CSF 中，來自 Human Neuroscience Panel 1 的 NSE 和 GFAP 均增加。

 

血清和血漿樣品

由於人類神經科學小組 2 也驗證了血清和血漿樣品，我們接下來檢測是否有任何分析物質在循環中表現出不同的蛋白質表達。AD患者的血漿和血清中FABP3都增加了，而AD血清中TREM2增加了，AD血漿中NRGN增加了（圖3）。

MILLIPLEX® 多元生物標誌物測量正常和 AD 血漿及血清樣本，包括 TREM2、FABP3 和神經粒蛋白。

圖 3. 在正常和 AD 血漿及血清樣本中進行多重 AD 生物標記測量。

MILLIPLEX® Human Neuroscience Panel 2 用於測量 AD 患者血漿 (n=5) 和血清 (n=6) 中的疾病相關蛋白質，以及健康對照組血漿 (n=12) 和血清 (n=8) 中的相關蛋白質。使用人類神經科學面板 2 分析血清和血漿，發現相較於健康對照組，AD 樣本中 TREM2 (血清 p=0.0083)、FABP3 (血清 p=0.0204, 血漿 p=0.002)、neurogranin (血漿 p=0.0044)增加。

高靈敏度結果

雖然有幾種分析物質被證實有潛力成為以血液為基礎的 AD 生物標誌物，但由於其他蛋白質的豐度較低，因此有必要使用 SMC® 技術在高靈敏度平台上開發檢測方法。SMC® 技術能夠測量人體血漿樣本中的β淀粉樣蛋白肽（圖 4）。血漿 Aβ40 的少量增加 (p=0.028) 與 AD 有關。血漿 Aβ42 值並無觀察到差異。重要的是，SMC® Aβ42試劑盒成功檢測出AD特有的CSF Aβ42下降（p=0.0116）。同時也觀察到 CSF 中 Aβ40 含量的差異 (p=0.0055)。在 SMCxPRO® 儀器上依序讀取 Aβ40 和 Aβ42 試劑盒，然後再用 ERENNA® 儀器讀取，證明 SMC® 儀器平台之間有極佳的相關性。

SMC® 高靈敏度免疫分析法測量正常和 AD 血漿和血清樣本中的生物標記，以及 CSF 樣本中 Aβ42 和 Aβ40 的相關性。

圖 4. 正常和 AD 血漿和血清樣本中的高靈敏度免疫分析生物標誌物測量以及 CSF 樣本的相關性。

使用各自的高靈敏度SMC®免疫分析法測量AD患者和健康對照組CSF和血漿中的Aβ40和Aβ42。在血漿 (p=0.028) 和 CSF (p=0.0055) 中均觀察到 AD 與健康對照組之間 Aβ40 的差異。在 AD CSF 中觀察到 Aβ42 下降 (p=0.0116)，但在血漿中則沒有觀察到任何變化 (p=0.9733)。在 SMCxPRO® 儀器上用來測量 CSF 的相同平板隨後在 ERENNA® 儀器上進行分析，如圖 4 所示，顯示兩個平台之間具有高度相關性。


每種試劑盒的樣本量如下：

  • SMC®淀粉樣 Beta 1-40 高靈敏度免疫分析試劑盒正常 CSF (n=20)、AD CSF (n=10)、正常血漿 (n=10)、AD 血漿 (n=10)
    • SMC® Amyloid Beta 1-42 高靈敏度免疫分析試劑盒 正常 CSF (n=8) 和 AD CSF (n=8)、正常血漿 (n=10) 和 AD 血漿 (n=10)

摘要

MILLIPLEX®® 免疫分析被用來測量 CSF、血漿和血清樣本中與神經退行性疾病有關的多種蛋白質。Aβ42和phospho-Tau等AD生物標誌物在CSF中顯示出預期的改變模式。此外，Neurogranin 和 GFAP 等蛋白質也在 AD CSF 中顯示出濃度升高。我們在血漿和血清樣本中分析了 AD 的潛在血液生物標記物，並發現了幾種有希望的候選物。

通過採用適合目的的方法，我們整合了多種技術平台和免疫分析方法，以分析CSF、血漿和血清樣本中的AD生物標誌物。這些 MILLIPLEX® 和 SMC® 免疫分析為研究人員提供了可靠的資源，以研究各種生物流體中廣泛的神經退行性疾病生物標誌物。

材料表
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僅供研究使用。不可用於診斷程序。

相關網路研討會

請觀賞以下的網路研討會，以瞭解有關這項研究的簡報。

腦脊液、血漿和血清中阿爾茨海默病生物標誌物的多重免疫分析檢測

索取有關 SMC® 神經學檢測的資訊
索取有關 MILLIPLEX® 分析的資訊

參考資料

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