动物组织DNA提取和WGA扩增实验方案

WGA扩增简介

动物组织是遗传分析中常用的材料来源。以下实验方案是从动物样品中提取DNA的简单方法。一旦分离出DNA，就可以使用WGA1和WGA2试剂盒通过全基因组扩增方法进行扩增。GenomePlex产品已用于扩增鸡、猪、牛、鱼和虾来源的基因组DNA。

建议使用GenElute哺乳动物基因组DNA Miniprep试剂盒 (G1N10)进行此程序。

1. 将20 mg组织放入微量离心管中。
2. 消化组织：将组织块重悬于180 μL裂解液T中。
3. 加入20 μL蛋白酶K，涡旋混合。
4. 在55°C下孵育2-4小时或过夜，直至组织完全溶解。在孵化过程中偶尔涡旋。
   可选的RNase处理：如果担心残留RNA，可加入20 μL的RNase A溶液，室温孵育2分钟。
5. 裂解细胞：涡旋 15 秒。向样品中加入200 μL裂解液C。对于均匀混合物的彻底涡旋对于有效裂解是必不可少的。在70 °C孵育10分钟。
6. 准备色谱柱：向每个预装GenElute微量提取吸附柱中加入500 μL柱制备液，12,000 × g离心1分钟。
7. 结合准备：向裂解的样品中加入200 μL乙醇，涡旋混匀。
8. 加裂解液：从步骤 5 开始将样品管的全部内容物转移到处理过的吸附柱中。≥ 6500 × g离心1分钟。弃去含有流通液的收集管，将吸附柱置于新的 2 mL 收集管中。
9. 第一次清洗：首次使用前，请按照配制说明书的说明用乙醇稀释洗涤液浓缩液。向吸附柱中加入500 μL洗涤液，并以≥6500 x g的转速离心1分钟。弃去含有流通液的收集管，将吸附柱置于新的2 mL收集管中。
10. 第二次洗涤：向吸附柱中再加入500 μL洗涤液，并以最大速度（12,000–18,000 × g）离心3分钟以干燥吸附柱。在洗脱柱上的 DNA 之前，吸附柱不含乙醇至关重要。如果看到残留乙醇，以最大速度将吸附柱再离心一分钟。最后丢弃含有流通液的收集管，并将结合柱放入新的2 ml收集管中。
11. 洗脱 DNA：将200 μL洗脱液直接移入吸附柱中心，室温孵育5分钟。以 ≥ 6500 × g离心1分钟以洗脱DNA。
12. 将DNA样品保存在-20°C。
    

WGA扩增

使用GenomePlex全基因组扩增试剂盒（WGA1）和/或完全全基因组扩增试剂盒（WGA2）进行GenomePlex全基因组扩增的实验方案。

断裂

1. 从上述全血提取实验方案制备1 ng/ml的DNA溶液。
2. 将1 μL 10X断裂缓冲液加入到PCR管中的10 μLDNA（1 ng/ μL）中。
3. 将试管置于95℃的热循环仪中刚好4分钟。
   注意：必须严格控制孵化时间，任何偏差都可能改变结果。 
4. 立即将样品置于冰上冷却，并短暂离心。

文库的制备

1. 加入2 μL 1x 文库制备缓冲液。 
2. 加入1 μL文库稳定化溶液。
3. 充分混合，置于95℃的热循环仪中2分钟。
4. 将样品置于冰上冷却，并短暂离心。
5. 加入1 μL文库制备酶，充分混匀，并短暂离心。
6. 将反应置于热循环仪中并以下列程序孵育：
      16 °C，20分钟
       24 °C，20分钟
       37 °C，20分钟
       75 °C，5分钟
        4 °C，维持
7. 从热循环仪中取出样品，并短暂离心。样品可立即扩增或在-20°C下储存最多三天。

扩增

1. 将以下试剂加入到整个15 ml反应物中：
      7.5 μL 10x 扩增预混液
      47.5 μL无核酸酶水
      5.0 μL JumpStart Taq DNA聚合酶（12.5单位），用于WGA1
      或者
      5.0 μL WGA DNA聚合酶，用于WGA2
2. 彻底涡旋，短暂离心，并开始热循环。
      初始变性：  95 °C，3分钟
      按以下进行14个循环：   
      变性：  95 °C，15秒
      退火/延伸：  65°C，5分钟
3. 循环完成后，将反应保持在4°C或储存在-20°C，直到准备好进行下一步的分析或纯化。

再扩增

1. 将10 μL 1 ng/μl WGA扩增的DNA加入PCR管或多孔板中。
   注意：必须清除WGA反应物，以减少再扩增中可能存在的偏差。我们建议使用我们的GenElute™ PCR清理试剂盒（货号NA1020）或分离单链和双链DNA的标准纯化方法。
2. 制备扩增混合物。对于每个再扩增反应，将以下试剂添加到WGA扩增的DNA中（步骤1）：
       47.5 μL无核酸酶水
       7.5 μL 10X 扩增预混液
       5 μL WGA DNA聚合酶
3. 彻底涡旋，短暂离心，并开始热循环。以下程序已针对PE 9700或同等热循环仪进行了优化：
       起始变性 95 °C，3分钟
       按如下所述进行14个循环：
       变性 94 °C，15秒
       退火/延伸：65 °C，5分钟
4. 循环完成后，将反应保持在4°C或储存在-20°C，直到准备好进行下一步的分析或纯化。WGA DNA的稳定性等同于在相同条件下储存的基因组DNA。
   

扩增产物的纯化

使用GenElute PCR纯化试剂盒（NA1020）进行扩增产物的纯化。

1. 将GenElute Miniprep结合柱（带蓝色O形环）插入提供的收集管中（如果尚未组装）。向每个小量制备柱中加入0.5 ml柱制备溶液，并以12,000 × g离心30秒至1分钟。丢弃洗脱液。
   注意：柱准备液可最大限度地增加DNA与膜的结合，从而获得更稳定的得率。
2. 将5倍体积的结合溶液加入到1倍体积的PCR反应物中，并混合。例如，向100 μL PCR反应物中加入500 μL结合溶液。将溶液转移到结合柱中。以最大速度（12,000至16,000 x g）离心色谱柱1分钟。丢弃洗脱液，但保留收集管。
3. 将结合柱装回收集管中。将0.5 ml稀释的清洗液加入柱中，以最大速度离心1分钟。丢弃洗脱液，但保留收集管。
   注意：在第一次使用之前，务必向浓缩清洗液添加乙醇。请参见制备说明。
4. 将柱装回收集管中。以最大速度离心结合柱2分钟以便除去过量的乙醇，请勿额外添加任何清洗液。丢弃任何残留的洗脱液以及收集管。
5. 将柱转移到新的2 ml收集管中。在每个柱的中心加入50 μL洗脱液或水。在室温下孵育1分钟。
   注意：用水洗脱时，确保水的pH值在5.5至8.5之间。也可以使用用水稀释10倍的洗脱液进行洗脱。
6. 为了洗脱DNA，以最大速度离心结合柱1分钟。PCR扩增产物现在存在于洗脱液中，可立即使用或在-20℃下储存。
   

扩增产物的量化

使用全基因组扩增法扩增的DNA的量可以在纯化或不纯化的情况下检测。对于最高质量的DNA样品，强烈建议在扩增后纯化样品。可以使用Molecular Probes Inc.的PicoGreen^® dsDNA定量测定（＃P-7589）测量扩增产物。另一种检测扩增产物的方法是在NanoDrop^®分光光度计上进行分光光度吸收（OD260）。该仪器可在大动态范围（2-3700 ng）上测量1 μL样品的吸光度。

应用数据

在各种动物组织上进行的全基因组扩增

我们的扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上可视化。每孔加载5 μL扩增产物。WGA扩增产物的平均大小为400 bp。如凝胶上所示，涂片图案因动物而异。使用WGA技术扩增的产物是特异性的，阴性对照中没有信号就说明了这点（泳道3）。

泳道1 - 1 kb标记物
泳道2 - 阳性对照
泳道3 - 阴性对照
泳道4 - 猪
泳道5 - 牛
泳道6 - 鸡
泳道7 - 鲶鱼
泳道8 - 虾

由用户提供的材料

• 动物组织样品
• 1.5 ml微量离心管
• 微量离心机（带 2 mL 试管的转子）
• 55 °C 水浴或加热块