GenElute™ 植物基因组DNA Miniprep试剂盒实验方案(G2N10, G2N70, G2N350)

产品描述

可在一小时内，从多达100 mg新鲜组织或10 mg冻干材料中获得数微克DNA。纯化的DNA长度大于20 kb，可用于敏感的下游应用，如限制性核酸内切酶消化和PCR扩增。

所含试剂	货号	G2N10	G2N70	G2N350
		10 份制剂	70 份制剂	350 份制剂
裂解液A	L7910	4 mL	30 mL	140 mL
裂解液B	L8035	1 mL	4 mL	20 mL
沉淀溶液	P9727	1.5 mL	11 mL	50 mL
结合液	B2177	8 mL	60 mL	280 mL
纯化柱制备液	C2112	7 mL	60 mL	225 mL
浓缩洗涤液	W3011	4 mL	30 mL	140 mL
洗脱液 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 约pH 8.0)	T7688	3 mL	20 mL	100 mL
GenElute管装过滤柱	C9346	10支装	70支装	支装5 x 70
管装GenElute核酸结合柱	C9471	10支装	70支装	支装5 x 70
采集管，2.0 mL 容量	T5449 或 T7813	支装3 x 10	支装3 x 70	支装15 x 70

自备试剂和设备

• 小研钵和杵
• 液氮
• 微量离心管
• 微量离心机*
• RNase A溶液，货号R4642
• 乙醇(95–100%)，货号E7148、E7023或459836
• 分子生物学试剂级水，货号W4502
• 65°C水浴

* 注意：为了确保所有试剂管的正确放置，建议使用 24 位转子。如果您使用的是36位转子，我们建议每隔一个位置放一个管。

储存方法和稳定性

室温储存试剂盒。如果试剂盒之中的试剂储存时形成沉淀，可55–65 °C温热至沉淀溶解。

制备说明

• 彻底混合试剂
  检查试剂是否有沉淀。如有任何试剂形成沉淀，以 55-65 °C 温热直至沉淀溶解，并在使用前冷却至室温。

• 65 °C预热水浴。

• 洗涤液
  用 9.5 mL（10 份装）、72 mL（70 份装）或 330 mL（350 份装）95-100%乙醇稀释浓缩洗涤液。每次使用后，拧紧稀释洗涤液的瓶盖以防止乙醇挥发。

• 65 °C预热洗脱液

操作流程

1.破裂细胞

在液氮中利用研钵和杵将植物组织研磨成细粉。将最多100 mg粉末转移到微量离心管中。将样品放在冰上备用或–70°C冷冻。

2.裂解细胞

向试管中加入350 µL裂解液A和50 µL裂解液B；涡旋倒置彻底混合。加入裂解液B后，随即形成白色沉淀。将混合物65°C孵育10分钟，偶尔倒置以溶解沉淀物。

Rnase选择性消化：该试剂盒用于选择性分离大分子DNA。如果发现制剂被RNA污染，可使用RNase A（非随附）消化RNA。65°C孵育前，将50单位的RNase A加入裂解混合物。

3.沉淀碎屑

向混合物中加入130 µL沉淀溶液；倒置完全混匀，然后将样品置于冰上5分钟。以最大速度(12,000–16,000 x g)离心样品5分钟，以沉淀细胞碎屑、蛋白质和多糖。

4.过滤细胞碎屑

将步骤3中的上清液小心吸取到GenElute过滤柱（带有2 mL收集管的蓝色嵌套）上。以最大速度离心1分钟。此步骤可除去步骤3中未去除的所有细胞碎屑。丢弃过滤柱，但保留收集管。

5.准备结合

将700 µL结合液直接加入步骤4的流通液中。倒置充分混匀。

6.准备结合柱

将GenElute Miniprep结合柱（带蓝色O形圈）插入随附收集管中（如果尚未组装）。向每个小量制备柱中加入0.5 ml柱制备溶液，并12000 x g 离心30秒至1分钟。丢弃流通液

注意：柱制备溶液可最大限度地提高DNA与膜的结合，从而获得更稳定的产量。

7.加裂解液

将步骤5中的700 µL混合物小心吸取至步骤6制备的过滤柱上，并以最大速度离心1分钟。丢弃流通液；保留收集管。将过滤柱放回收集管。将步骤5中剩余的裂解液加到过滤柱上。重复上述离心步骤，丢弃流通液和收集管。

8.第一次洗涤柱

首次使用前，务必在浓缩洗涤液中添加乙醇。将结合柱放入一支新的2 mL收集管中，然后将500 µL稀释洗涤液加到柱上。以最大速度离心1分钟。丢弃流通液，但保留收集管。

9.第二次洗涤柱

另取500 µL稀释的洗涤液加到柱上，以最大速度离心3分钟以干燥柱。勿让流通液接触柱；擦去附着在柱外部的所有液体。

10.洗脱DNA

将结合柱转移到一支新2 mL收集管中。将100 µL预热（65°C）洗脱溶液加到柱上，以最大速度离心1分钟。再次洗脱。请勿让流通液接触柱。洗脱液可收集在同一收集管中。也可另用一支收集管收集第二遍洗脱液，以免稀释第一遍洗脱液。

洗脱液含有纯基因组DNA。建议2-8°C短期储存DNA。建议-20 °C长期储存DNA。避免冻融，以免引起DNA链断裂。洗脱液有助于在这些温度下稳定DNA。

DNA 沉淀（可选）

GenElute血液基因组DNA试剂盒可让DNA始终保持在溶液中，从而避免重悬问题。但是，如果您发现有必要浓缩 DNA，建议使用含乙酸钠的乙醇沉淀。¹

替代破坏程序

由于大多数植物细胞周围围绕着坚硬细胞壁且许多物种细胞壁为纤维性质，从植物组织中提取核酸较为复杂。有多种方法可破坏植物材料。最有效和常用的方法之一是在液氮中用研钵和杵研磨组织。GenElute植物基因组DNA Miniprep试剂盒基于这种有效破坏方法开发，但也可使用其他破坏技术代替该过程的步骤1。

还可从冻干组织获取高产量的高分子量DNA。干燥组织应采用研钵和研杵研磨成细粉；单份DNA制剂最多可使用20 mg这种粉末。研磨冻干组织过程中，不一定要使用液氮。将组织磨成粉末后，从步骤2开始执行前述步骤。

结果

通过分光光度分析和琼脂糖凝胶电泳，确定植物DNA浓度和纯度。260 nm至280 nm的吸光度之比(A₂₆₀/A₂₈₀)应为1.7至1.9。通过琼脂糖凝胶电泳或脉冲场电泳，可测定DNA大小和质量。

图 1. 从基因组DNA分离PCR扩增500 bp产物。使用GenElute™植物基因组DNA Miniprep试剂盒，从大豆叶纯化基因组DNA。在20 µL总PCR反应中，以5 µL等分洗脱液为模板进行30次循环。取5μL各PCR反应等分试样，在2％预制琼脂糖凝胶（货号P5722）上进行分离。所用的PCR分子量标准品（M）（货号P9577）大小为50 bp至2 kb。

表1.从100 mg各植物物种组织提取DNA的典型产量

植物	DNA得率	植物	DNA得率
玉米	7.5 µg	烟草	5.2 µg
石竹组织培养	3.3 µg	番茄	6.2 µg
胡椒	3.1 µg	西红柿（20 mg冻干叶组织）	5.7 µg
大米	5.9 µg
大豆	5.7 µg	小麦	11.5 µg

图 2. 利用GenElute™植物基因组DNA Miniprep试剂盒分离各种植物的基因组DNA。在0.8％琼脂糖凝胶上分析纯化的基因组DNA（0.4μg/泳道）。分子量标准品为lambda Hind III消化液。

故障排除指南

结合柱堵塞。	原因— 样品太大。 解决方案 — 针对之后的制备工作，减少植物组织用量。若要挽救当前制剂，请提高转速和/或延长旋转时间，直到裂解液通过吸附柱。DNA产量可能下降。
	原因 — 组织未充分破坏。 解决方案 — 按照本实验方案步骤1彻底破坏起始材料。如果使用其他方法，请确保组织有效破坏。
DNA产量过低。	原因 — 样品可能陈旧或降解。 解决方案 — 不同类型植物组织和植物物种间，产量会有所不同。如果可能，请使用尽可能鲜嫩的叶片或组织。如果要存储样品以备将来使用，请在液氮中速冻并–70°C储存。
	原因 — 组织未充分破坏。 解决方案 — 不同类型植物组织和植物物种间，产量会有所不同。如果可能，请使用尽可能鲜嫩的叶片或组织。如果要存储样品以备将来使用，请在液氮中速冻并–70°C储存。
	原因—洗脱液中含有洗涤液中残留的乙醇。 解决方案—在洗脱 DNA 之前，必须去除最后洗涤液中残留的乙醇。按步骤9的建议，需要延长离心时间或加大离心速度，以便干燥膜。如果包含乙醇的流通液接触吸附柱，需在洗脱 DNA 之前重复离心步骤。
	原因—洗涤浓缩液在使用前未经稀释。 解决方案—使用前确认浓缩洗涤液是否用乙醇适当稀释。
	原因—DNA 洗脱不完全。 解决方案—确认DNA已用100 μL洗脱液洗脱。可以使用 100 μL 洗脱溶液进行第二次和第三次洗脱。
	原因 — 用水替代洗脱液进行了洗脱。 解决方案 — 建议使用洗脱液洗脱，以实现纯化 DNA 的最佳产率和贮存。如果用水洗脱 DNA，请确认 pH 值至少为 7.0，以避免在酸性条件下储存较长时间后DNA会被酸水解。
DNA纯度低于预期：A260/A280比率过低。	原因 — 纯化不完全。 解决方案 — 减少初始样品体积。
	原因 — 硅粉造成背景读数较高。 解决方案 — 将 DNA 样品以最大速度离心 1 分钟；使用上清液重复读取吸光度。
DNA纯度低于预期：A260/A280比率过高。	原因 — 基因组 DNA 被 RNA 污染。 解决方案 — 在后续分离时加入 RNase A处理步骤，或用RNase A溶液处理最终产物并再次纯化。
DNA 被剪切。	原因 — DNA样品过度误操作。 解决方案 — 所有移液步骤应尽可能温和地执行。建议使用大口径移液器吸头，以帮助消除可能的剪切效应。不可涡旋。
	原因 — 样品陈旧、降解或已经历多次冻/融循环。 解决方案 — 陈旧的起始材料可能在洗脱液中产生降解DNA。现配制剂应立即使用，或在液氮中冷冻并–70°C储存至临用前。
抑制下游应用。	原因 — 乙醇被带入最终的基因组DNA制备液 解决方案 — 最终洗涤吸附柱（步骤9）后，不允许流通液接触柱。如有必要，在清空收集管后再以最大速度(12,000-16,000 x g)离心柱子1分钟。
	原因—盐被带入最终的基因组 DNA 制剂中。 解决方案 — 在步骤 8 中添加洗涤液之前，确认吸附柱转移到全新2 mL收集管中。用500 µL洗涤液冲洗两遍。

注意事项和免责声明

GenElute植物基因组DNA Miniprep试剂盒仅用于实验室用途。不可用于药物、家用或其他用途。裂解液A和结合液含有对人体有害的硫氰酸胍。柱制备液具有刺激性。避免接触皮肤。处理这些溶液或随试剂盒提供的任何试剂时，请戴上手套、安全眼镜和合适的防护服。有关危险和安全处理方法的信息，请参阅材料安全数据说明书(SDS)。

参考文献

1. Malke H. 1990. J. SAMBROCK, E. F. FRITSCH and T. MANIATIS, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Second Edition), Volumes 1, 2 and 3.1625 S., zahlreiche Abb. und Tab. Cold Spring Harbor 1989.Cold Spring Harbor Laboratory Press.$ 115.00.ISBN: 0-87969-309-6. J Basic Microbiol. 30(8):623-623. https://doi.org/10.1002/jobm.3620300824

2. BIRREN B, LAI E. 1993. FIELD INVERSION GEL ELECTROPHORESIS.121-128. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-101290-8.50011-0