REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒实验方案

货号XNATS, XNAT, XNATR

概览

REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒包含从小鼠尾巴和其他动物组织、口腔拭子、毛干和唾液中快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之，在室温下将样品与提取溶液和组织制备溶液的混合物孵育10分钟，原料即可释放DNA。不需要机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。  

加入中和溶液B后，提取物可用于PCR。然后将等分的中和后的提取物与REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物和用户提供的PCR引物组合，即可扩增靶DNA。REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物是含有缓冲液、盐、dNTP和Taq聚合酶的2X反应混合物。其专门针对反应试剂进行了优化。它还含有JumpStart™ Taq抗体（用于热启动PCR以增强特异性），以及REDTaq^® 染料（以将PCR产物直接加载到琼脂糖凝胶上）。

所含试剂	货号	XNATS 10份制剂， 10份PCR	XNAT 100份制剂， 100份PCR	XNATR 1000份制剂， 1000份PCR
提取液	E7526	2.5 mL	24 mL	240 mL
组织制备溶液	T3073	0.3 mL	3 mL	30 mL
中和液 B	N3910	2.5 mL	24 mL	240 mL
REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物 这是含有缓冲液、盐、dNTP、Taq聚合酶、REDTaq®染料和JumpStart Taq抗体的2X PCR反应混合物。	R4775	0.15 mL	1.2 mL	12 mL

需要但未提供的试剂和仪器：

• 微量离心管（1.5或2 mL）或多孔板用于提取（200 μL最小孔容积）
• 剪刀，微型切割，货号Z265985
• 镊子（中小款）
• 口腔拭子（无菌泡沫尖涂抹器，货号A9601）
• 样品采集卡 — 血迹卡，货号C2613
• 用于PCR的管或板
• 95°C加热块或热循环仪
• PCR引物
• 热循环仪
• 水，PCR试剂，货号W1754
  

操作流程

除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。

A. 从小鼠尾巴、动物组织、毛发或唾液中提取DNA

1. 移取100 μL提取溶液到微量离心管或多孔板的孔中。向管或孔中加入25 μL组织制备溶液，上下移液混合。
   
   注意：如果要进行多次提取，可以在使用前最多2小时以4:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。
    
2. 对于新鲜或冷冻的小鼠尾巴：在使用前及处理不同样品的间隙，采用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。将0.5-1 cm的小鼠尾尖（切割端向下）放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保小鼠尾巴浸没在溶液中。
   
   注意：对于新鲜小鼠尾巴，请在剪断尾巴后30分钟内进行提取。
   
   对于动物组织：在使用之前及处理不同样品的间隙，采用70％乙醇冲洗剪刀或手术刀和镊子。将2-10 mg组织块放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保组织浸没在溶液中。
   
   对于发干：在使用前及处理不同样品的间隙，采用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。剪去多余的发干，保留发根，将样品（根端向下）放入溶液中。每次提取只需要一根带根的发干。
   
   对于唾液：移取10 μL唾液到溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。
   
   对于在卡片上干燥的唾液：将50 μL唾液吸移到收集卡上，并使卡片干燥。使用前和不同样品之间用70％乙醇冲洗打孔器。在卡上有干燥唾液样品的区域用打孔机冲下一片圆片（最好是1/8英寸或3 mm）。将圆片放入溶液中。在硬表面上轻敲管或板，以确保圆片在培养期间浸于溶液中。
    
   
3. 在室温下孵育样品10分钟。 
   
4. 将样品在95°C孵育3分钟。
   注意：孵育结束时组织不会被完全消化。这是正常现象，不会影响性能。
    
   
5. 向样品中加入100 μL中和溶液B，并涡旋混合。 
   
6. 将中和的组织提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。
   注意：长期储存时，取出未消化的组织，或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月，在大多数情况下没有明显的损失。
   

注意：第C部分第1步 — 长期储存时，取出未消化的组织，或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月，在大多数情况下没有明显的损失。

B. 口腔拭子的DNA提取

1. 收集拭子上口腔细胞，让拭子干燥。干燥时间约为10至15分钟。
   注意：由于用于DNA提取的溶液体积较小，应使用泡沫尖端拭子。应避免使用纤维尖端的拭子，如棉花或涤纶拭子，因为溶液无法有效回收。 
   
2. 移取200 μL提取溶液到1.5 mL微量离心管中。向管加入25 μL组织制备溶液，上下移液混合。
   注意：如果要进行多次提取，可以在使用前最多2小时以8:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。 
   
3. 将干燥的口腔拭子放入溶液中并在室温下孵育1分钟。 
   
4. 在溶液中转动拭子10次，然后将拭子转动着在管壁上抿，以从拭子中将多余的溶液挤出。丢弃拭子。盖上管盖并短暂离心。 
   
5. 在室温下孵育样品10分钟。 
   
6. 将样品在95°C孵育3分钟。 
   
7. 向样品中加入200 μL中和溶液B，并涡旋混合。 
   
8. 将中和的提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。
   注意：提取物可在4 °C下储存至少6个月，在大多数情况下没有明显的损失。
   

C. PCR扩增

REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物含有JumpStart Taq抗体，用于特定的热启动扩增。因此，PCR反应可以在室温下进行而不会过早产生Taq DNA聚合酶活性。

典型的最终引物浓度约为0.4 μM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

     1.将以下试剂加入到薄壁PCR微量离心管或板中：

试剂	体积
PCR级水	x μL
REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物	10 μL
正向引物	y μL
反向引物	y μL
组织提取物	4 μL*
总体积	20 μL

注意：REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物配方用于补充提取、组织制备和中和溶液中的成分。如果将少于4 μL的组织提取物添加到PCR反应物中，则按50:50的提取物：中和溶液B混合比例，使组织提取物的体积达到4 μL。

     2.轻轻混合。
     3.对于没有加热盖的热循环仪，在每个管的混合物顶部添加20 μL矿物油以防止蒸发。                        进行热循环。扩增参数应
4. 针对各个引物、模板和热循环仪进行优化。

	常用循环参数
步骤	温度	时间	循环数
初始变性：	94 °C	3分钟	1
变性	94 °C	0.5-1分钟	30-35
退火	45 - 68 °C	0.5-1分钟
延伸	72 °C	1-2 分钟 (~ 1 kb/min)
最后延伸	72 °C	10分钟	1
最终保持	4 °C	无限

5.PCR结束后，将扩增的DNA加到琼脂糖凝胶上。不必加入单独的 上样缓冲液/示踪染料。
注意：如果需要，可以对PCR产物进行纯化，用于下游应用，例如使用GenElute^TM PCR清除试剂盒（货号NA1020）进行测序。

故障排除

问题	原因	解决方案
检测到很少或没有PCR产物	由于组织提取物中的污染物，PCR反应可能被抑制。	用50:50的提取溶液与中和溶液混合物稀释组织提取物。为了测试抑制，使用DNA对照和/或将已知量的模板（100-500个拷贝）与组织提取物一起加入PCR中。
	提取物不够	将样品在55°C下而不是室温下孵育10分钟。
	PCR组分可能缺失或降解。	运行阳性对照以确保组分功能正常。  还建议在组合各个反应时使用核查表。
	也许执行的循环数太少。	增加循环次数（每次增加5-10个循环）。
	退火温度可能太高。	以2-4°C的增量降低退火温度。
	引物的设计可能不是最佳。	确认序列信息的准确性。  如果引物长度小于22个核苷酸，则尝试加长引物至25-30个核苷酸。如果引物的GC含量低于45％，尝试重新设计GC含量为45-60％的引物。
	变性温度可能太高或太低。	按1℃的增量增加或降低温度，以优化变性温度。
	变性时间可能太长或太短。	按10秒的增量增加或缩短时间，以优化变性时间。
	延伸时间可能太短。	按1分钟的增量增加延伸时间，尤其是对于长模板。
	靶模板很困难。	大多数情况下，由于GC含量异常高和/或二级结构，靶标本就复杂。据报道，在1.0-1.7 M的浓度下，甜菜碱（货号：B0300）有助于扩增高GC含量的模板。
多种产物	JumpStart Taq抗体无法正常工作	不要将DMSO或甲酰胺与REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物一起使用。它会干扰酶-抗体复合物。其他助溶剂、溶质（例如盐）以及极端的pH值或其他反应条件，可能降低了JumpStart抗体对Taq聚合酶的亲和力，从而损害了它的有效性。
	可能需要进行递减PCR。	“递减”PCR可显著提高各种应用中许多PCR反应的特异性。递减PCR包括在初始PCR循环期间使用高于引物TM的退火/延伸温度。然后在剩余的PCR循环中将退火/延伸温度降低至引物TM。可以在一个步骤中进行更改，也可以在几个周期内递减。
阴性对照显示PCR产物或“假阳性”结果	试剂被污染	我们建议在每次PCR运行中使用不含DNA模板的试剂空白作为对照，以确定提取或PCR中使用的试剂是否被来自先前反应的模板污染。
孵育后组织未被消化。	组织本来就不会被完全消化。	REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒不要求组织被完全消化。不需完全消化组织即可释放足够的DNA用于PCR。
口腔拭子吸收了所有溶液	未使用推荐类型的拭子。	由于用于DNA提取的溶液体积较小，应使用泡沫尖端拭子。应避免使用纤维尖端的拭子，如棉花或涤纶拭子，因为溶液无法有效回收。

参考文献

1. Dieffenbach C, Dveksler G. 1995. PCR Primer: A Laboratory Manual. Catalog Number Z364118. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Don R, Cox PT, Wainwright B, Baker K, Mattick JS. 1991. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008-4008. https://doi.org/10.1093/nar/19.14.4008

3. Erlich HA. 1989. PCR Technology. https://doi.org/10.1007/978-1-349-20235-5

4. Griffin H, Griffin A. 1994. PCR Technology: Current Innovations. Boca Raton: CRC Press.

5. Innis M. 1995. PCR Strategies. Catalog Number Z357499. New York: Academic Press.

6. Innis M. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Catalog Number P8177. San Diego, California: Academic Press.

7. M.J M. 1995. PCR 2: A Practical Approach. Catalog Number Z362387. New York: IRL Press.

8. Newton C. 1995. PCR: Essential Data. New York: John Wiley & Sons.

9. Roux KH. 1995. Optimization and troubleshooting in PCR.. Genome Research. 4(5):S185-S194. https://doi.org/10.1101/gr.4.5.s185

10. Erlich HA. 1989. PCR Technology. London: Palgrave Macmillan UK.

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JumpStart和JumpStart抗体在美国获得许可。专利号5,338,671和5,587,287以及在其他国家的相应专利。

GenElute、JumpStart和REDExtract-N-Amp是Sigma-Aldrich Co. LLC.的商标。
REDTaq是Sigma-Aldrich Co. LLC.的注册商标。