Trombina Czynnik IIa
Specyficzność
Trombina jest endolityczną proteazą serynową, która selektywnie rozszczepia wiązania Arg--Gly fibrynogenu, tworząc fibrynę i uwalniając fibrynopeptydy A i B.1,2
Optymalne miejsca rozszczepienia dla trombiny zostały określone jako 1) A-B-Pro-Arg-||-X-Y, gdzie A i B są aminokwasami hydrofobowymi, a X i Y są aminokwasami niekwaśnymi oraz 2) Gly-Arg-||-Gly.2
Trombina pochodząca od dowolnego gatunku ssaków będzie krzepnąć z fibrynogenu dowolnego innego gatunku ssaków.3
Trombina rozszczepia fibrynogen na 2 sposoby, ale tylko w miejscach argininowych. Pierwotny produkt rozszczepienia, fibrynopeptyd A jest odszczepiany od fibrynogenu po aminokwasie 16 i czasami po aminokwasie 19, podczas gdy wtórny produkt rozszczepienia,&fibrynopeptyd B jest wytwarzany przez rozszczepienie przy aminokwasie 14.4
Thrombina jest aktywna w zakresie pH 5-10.5
Optimum katalityczne wynosi pH 8,3.5
Trombina wytrąca się przy pH 5 lub niższym.5
Trombina nie wymaga do aktywności dwuwartościowych jonów metali lub kofaktorów. Wykazano jednak, że zależna od Na+ allosteryczna aktywacja trombiny odgrywa rolę w definiowaniu pierwotnej specyficzności trombiny do rozszczepiania po resztach Arg.6 Tromobmodulina służy jako kofaktor trombiny podczas aktywacji białka C.7
In vivo Przetwarzanie i właściwości fizyczne
.Dominującą formą trombiny in vivo jest jej zymogen, protrombina (czynnik II), która jest produkowana w wątrobie. Stężenie protrombiny w normalnym ludzkim osoczu wynosi ~5-10 mg/dl.8 Protrombina jest glikoproteiną o zawartości glikanu ~12%.8
Protrombina jest rozszczepiana in vivo przez aktywowany czynnik X uwalniając peptyd aktywacyjny i rozszczepiając trombinę na łańcuchy lekkie i ciężkie, dając katalitycznie aktywną α-trombinę. α-trombina składa się z łańcucha lekkiego (łańcuch A) (MW ~ 6000) i łańcucha ciężkiego (łańcuch B) (~ 31 000). Te dwa łańcuchy są połączone jednym wiązaniem dwusiarczkowym.12 Łańcuch B ludzkiej trombiny składa się z części peptydowej (MW 29,485) i części węglowodanowej (2334) z glikozylacją związaną z N w trzech miejscach Asn.9,10 Trombina bydlęca zawiera 1,7% glukozaminy, 1,8% kwasu sialowego, 0,61% galaktozy i 0,95% mannozy.11 Trombina zawiera również reszty γ-karboksyglutamylowe. Te zmodyfikowane reszty glutamylowe są wynikiem karboksylacji przez enzym mikrosomalny, karboksylazę zależną od witaminy K. Reszty γ-karboksyglutamylowe są niezbędne do zależnej od wapnia interakcji z ujemnie naładowaną powierzchnią fosfolipidową, która jest niezbędna do konwersji protrombiny do trombiny.12 In vivo protrombina jest aktywowana na powierzchni błony fosfolipidowej, która wiąże aminowy koniec protrombiny wraz z czynnikami Va i Xa. Proces aktywacji rozpoczyna się powoli, ponieważ sam czynnik V musi zostać aktywowany przez początkowe niewielkie ilości trombiny.
W pewnych warunkach przechowywania autolityczne trawienie α-trombiny powoduje powstawanie β- i γ-trombin, które nie mają aktywności fibrynolitycznej, ale zachowują pewną aktywność wobec syntetycznych substratów peptydowych i substratów białkowych innych niż fibrynogen.13 Nasze preparaty trombiny są głównie formą α-trombiny.
Trombina ludzka składa się z kilku izozymów o punktach izoelektrycznych w zakresie 6,35-7,6.
Dla bydła zakres pI wynosi 7,05 - 7,114
E1%(280nm) = 18.3 (ludzki)15
E1%(280nm) = 19.5 (bydlęcy)16
Pomiar aktywności trombiny
Nasza procedura oznaczania trombiny jest wyrażona w jednostkach NIH uzyskanych przez bezpośrednie porównanie z referencyjnym wzorcem trombiny NIH.
Procedura testu NIH wykorzystuje 0,2 ml rozcieńczonego osocza (1:1 z solą fizjologiczną) jako substrat i 0,1 ml próbki trombiny (stabilizowanej w 1% buforowanym roztworze albuminy o pH 7,35) w oparciu o modyfikację metody Biggsa.17 Tylko czasy krzepnięcia w zakresie 15-25 sekund są używane do określania stężeń trombiny.
Stężenia trombiny w literaturze są zwykle podawane w kategoriach różnych jednostek aktywności.18-20
W literaturze dotyczącej trombiny stosuje się kilka konwencji:
1 jednostka WHO = 1 jednostka NIH
1 jednostka NIH = 1 jednostka USP
1 jednostka NIH = 0,324 +/- 0,073 µg
1 jednostka IOWA = 0.83 jednostki NIH
Trombina (ludzka i bydlęca) katalizuje hydrolizę kilku peptydowych p-nitroanilidów, estru tozylo-arg-nitrobenzylowego i syntetycznych substratów estru tiobenzylowego.21
Applications
Produkcja skrzepu fibryny w osoczu:
Zazwyczaj jedna do dwóch jednostek trombiny skrzepnie jeden ml osocza.
Rozszczepianie białek fuzyjnych:
Trombina może być stosowana do rozszczepiania wielu peptydów w miejscu rozpoznawania trombiny przy użyciu stężeń 0,5 jednostek NIH trombiny na jeden nanomol polipeptydu w 20 mikrolitrach 50 mM wodorowęglanu amonu, pH 8,0.22
Rozszczepienie białek fuzyjnych przez trombinę można przeprowadzić przy stosunku trombiny do białka fuzyjnego wynoszącym 1:500.23
Białka fuzyjne mogą być rozszczepiane w buforze do rozszczepiania trombiny składającym się z 50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2 i 0,1% 2-merkaptoetanolu. 2 mg białka fuzyjnego inkubowano z 4 µg trombiny przez 20 minut w RT w buforze rozszczepiającym.24
Substraty
Naturalne substraty
Fibrynogen, czynnik V,25czynnik VIII,25 czynnik XIII,25 trombospondyna,26 protrombina,12 i białko C.27
Syntetyczne substraty
N-Benzoyl-Phe-Val-Arg 4-metoksy-b-naftyloamid, .N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilide, Boc-β-benzylo-Asp-Pro-Arg-7-amido-4-metylokumaryna, Boc-Val-Pro-Arg-7-amido-4-metylokumaryna, Sar-Pro-Arg p-nitroanilid, Chromogeniczna generacja trombiny, N-p-Tosyl-Gly-Pro-Arg 7-amido-4-metylokumaryna, N-(p-Tosyl)-Gly-Pro-Arg p-nitroanilide.
Inhibitory
Diizopropylofluorofosforan,28 fluorek fenylometylosulfonylu, 28 AEBSF, hirudyna,28 tetranitrometan,28 proflawina,28 antytrombina III,28 a1-antytrypsyna28 , a1-antyplazmina,28 mezylan gabeksatu,29 przeciwbólowy,30 i chlorometyloketon tozylo-L-lizyny.31
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?