Rola jelitowych transporterów zwrotnych we wchłanianiu leków

Michael D. Mitchell, David C. Thompson

Wchłanianie leku w jelicie

Kluczowym aspektem opracowania skutecznego leku jest zaprojektowanie go tak, aby mógł być skutecznie dostarczony do zamierzonego miejsca działania. Wchłanianie leku jest kluczowym elementem osiągnięcia dobrej biodostępności i zapewnienia, że lek jest w stanie dotrzeć do krążenia ogólnoustrojowego. W przypadku leków doustnych większość wchłaniania leku zachodzi w jelicie cienkim, gdzie obecność kosmków i mikrokosmków znacznie zwiększa powierzchnię dla optymalnego wchłaniania. Na wchłanianie leku w jelicie cienkim duży wpływ ma wiele współdziałających czynników, w tym właściwości leku (rozpuszczalność, skład, stężenie itp.), właściwości przewodu pokarmowego (pH, spożycie pokarmu, region jelita cienkiego itp.), metabolizm, przepuszczalność i aktywny transport przez błonę nabłonkową jelita.

Transportery wypływu w jelicie

Błonowe białka transportujące leki zostały zidentyfikowane jako determinanty rozmieszczenia leków w organizmie, potencjalnie wpływające na wchłanianie, farmakokinetykę, interakcje lek-lek i profile bezpieczeństwa. Główne transportery wypływu z rodziny ABC obejmują MDR1 (P-glikoproteina, P-gp,  ABCB1), BCRP (ABCG2) i MRP2 (ABCC2). Są one zlokalizowane w tkankach barierowych organizmu, takich jak jelita, wątroba, nerki, bariera krew-mózg i łożysko, gdzie przepuszczają szeroki zakres ksenobiotyków, takich jak statyny, antybiotyki makrolidowe, blokery angiotensyny i środki chemioterapeutyczne, wpływając na ekspozycję i klirens in vivo.

W jelicie, interakcje lek-transporter obejmujące transportery wypływu często powodują słabe wchłanianie i niską biodostępność po podaniu doustnym, ponieważ lek jest łatwo wypływany z powrotem do światła jelita i wydalany z organizmu. Biorąc pod uwagę, że zdecydowana większość leków jest opracowywana do podawania doustnego, wykorzystanie testów przepuszczalności i transporterów in vitro stało się krytycznym narzędziem do oceny potencjalnych in vivo właściwości absorpcyjnych leku.

In Vitro Modele transporterów

Chociaż istnieje wiele in vitro modeli do testowania leków zarówno pod kątem przepuszczalności jelitowej, jak i odpowiedzialności za wypływ, test Caco-2 jest stosowany od ponad dwóch dekad i wykazuje dobrą korelację z ludzką przepuszczalnością i aktywnym wypływem dla większości leków. Caco-2 cells, derived from a patient with a colon adenocarcinoma, exhibit features in culture demonstrating key human physiology found in the small intestine, including expression of the major efflux transporters on the apical membrane and robust efflux activity when used in the a 21-day bidirectional transwell assay.

Obecne testy transporterów komórkowych, takie jak test Caco-2, wymagają użycia związków specyficznych dla transportera jako substratów lub inhibitorów w celu identyfikacji potencjalnych interakcji lek-transporter. Jednakże substraty są często rozpoznawane przez wiele transporterów z różnym powinowactwem, a specyficzność inhibitorów jest często nieznana lub słaba, co prowadzi do niejednoznacznych interpretacji interakcji lek-transporter. Na przykład MK571 jest wysoko ceniony jako selektywny inhibitor transportera MRP2. Jednak w stężeniach, które są zwykle stosowane przez badaczy, 25 - 50 µM, MK571 skutecznie hamuje inne główne transportery wypływu BCRP i MDR1.

Caco-2 Efflux Transporter Knockout Cells

Używając CompoZr^® Zinc Finger Nucleases (ZFNs), MDR, BCRP i MRP2 efflux transporter genes were targeted for ZFN-mediated knockout in the C2BBe1 Caco-2 cell line. Wynikowy panel pojedynczych i podwójnych komórek knockout (KO) wykazał zakłócenie sekwencji genu, jak również całkowitą utratę funkcji transportera w testach transportu dwukierunkowego do co najmniej 40 przejść po modyfikacji genomu ZFN.

Panel pojedynczych i podwójnych komórek knockout (KO)

Te nowe linie komórkowe typu knockout mogą być wykorzystane do identyfikacji specyficznych interakcji lek-transporter poprzez porównanie transportu leku między liniami komórkowymi typu dzikiego (WT) i typu knockout. Przykładowe dane przedstawiono dla kilku modelowych związków, o których wiadomo, że są substratami dla tych transporterów wypływu - digoksyny i erytromycyny (MDR1), 3-siarczanu estronu i nitrofurantoiny (BCRP) oraz CDCF (MRP2). W każdym przypadku stosunek wypływu związku zmniejsza się do jedności w odpowiedniej linii komórkowej KO w porównaniu z linią komórkową WT (Ryc. 1, 2 i 3). Ponadto, cymetydyna została zidentyfikowana jako podwójny substrat zarówno dla transporterów MDR1, jak i BCRP przy użyciu pojedynczych i podwójnych linii komórkowych KO w porównaniu do WT (Rysunek 4).

Te nowe linie komórkowe z nokautem transportera wypływu jelitowego zostały w pełni scharakteryzowane i okazują się być potężnymi narzędziami do wyjaśnienia interakcji lek-transporter bez zależności od inhibitorów chemicznych oraz do wyjaśnienia potencjalnego wpływu określonych transporterów wypływu na wchłanianie i dyspozycję leków. Te linie komórkowe są obecnie dostępne dla naukowców akademickich i farmaceutycznych oraz organizacji zajmujących się badaniami kontraktowymi (CRO) w wielu formatach, w tym licencjonowania i niedawno wprowadzonego formatu płytek gotowych do testów.

Rysunek 1. Wysięk substratów P-gp w liniach komórkowych typu dzikiego (WT) i liniach komórkowych z nokautem MDR1 (KO)

Rysunek 2. Wypływ substratów BCRP w liniach komórkowych typu dzikiego (WT) i z nokautem BCRP (KO)

Rysunek 3. Wypływ substratu MRP2 CDCF w liniach komórkowych typu dzikiego (WT) i z nokautem MRP2 (KO)

Rysunek 4. Wysięk cymetydyny w liniach komórkowych typu dzikiego (WT) oraz liniach komórkowych z nokautem (KO) P-gp, BCRP i MRP2

Referencje

1. Pratt J, Venkatraman N, Brinker A, Xiao Y, Blasberg J, Thompson DC, Bourner M. 2012. Use of Zinc Finger Nuclease Technology to Knock Out Efflux Transporters in C2BBe1 Cells. Current Protocols in Toxicology. 52(1): https://doi.org/10.1002/0471140856.tx2302s52

2. 2010. Membrane transporters in drug development. Nat Rev Drug Discov. 9(3):215-236. https://doi.org/10.1038/nrd3028

3. Zamek-Gliszczynski MJ, Hoffmaster KA, Tweedie DJ, Giacomini KM, Hillgren KM. 2012. Highlights from the International Transporter Consortium Second Workshop. Clin Pharmacol Ther. 92(5):553-556. https://doi.org/10.1038/clpt.2012.126

4. Matsson P, Pedersen JM, Norinder U, Bergström CAS, Artursson P. 2009. Identification of Novel Specific and General Inhibitors of the Three Major Human ATP-Binding Cassette Transporters P-gp, BCRP and MRP2 Among Registered Drugs. Pharm Res. 26(8):1816-1831. https://doi.org/10.1007/s11095-009-9896-0