Szybkie zatężanie przeciwciał za pomocą filtrów odśrodkowych Amicon^® Ultra

Wprowadzenie

Protokoły oczyszczania immunoglobulin zazwyczaj obejmują wiązanie powinowactwa do podłoża chromatograficznego z białkiem A lub G, przemywanie niezwiązanych białek i elucję buforem o niskim pH. Uzyskane w ten sposób oczyszczone przeciwciała są często zbyt rozcieńczone do dalszych badań lub długotrwałego przechowywania. Dializa jest często konieczna do zagęszczenia przeciwciała i/lub wymiany buforu na taki, który zachowuje aktywność białka. Ultrafiltracja pozwala osiągnąć ten sam wynik szybciej, z odzyskiem do 99% immunoglobulin i jednoetapowym usuwaniem soli (patrz protokół zagęszczania, odsalania i wymiany buforu).

Metoda i wyniki

Oczyszczanie i zatężanie króliczych IgG za pomocą Prosep^® A i Prosep^® G Montage^® Antibody Purification Kits i filtrów odśrodkowych Amicon^® Ultra-15 mL.

A. Oczyszczanie IgG przy użyciu zestawów Montage^®

1. Wyrównać Prosep^® A lub Prosep^® G z 10 mL buforu wiążącego i wirować przez 5 min przy 500 xg
2. Wstępnie oczyścić próbkę surowicy przepuszczając ją przez 0.22 µm filtr Steriflip^® GP.
3. Rozcieńczyć próbkę 1:1 buforem wiążącym A i odwirować urządzenie przy 100-150 x g przez 20 min.
4. Przepłukać kolumnę wirówkową 20 ml buforu wiążącego A w celu usunięcia niezwiązanych zanieczyszczeń przez wirowanie kolumny przez 5 min przy 500 x g.
5. Elutować próbki przez dodanie 10 ml buforu elucyjnego B2 do świeżej probówki wirówkowej zawierającej 1,3 ml buforu neutralizującego.3 ml buforu neutralizującego.
6. Pomiar całkowitego stężenia białka w próbce przy użyciu odpowiedniej metody zatężania, takiej jak absorbancja UV przy 280 nm.

B. Stężenie IgG przy użyciu urządzeń Amicon^® Ultra-15 30kDa MWCO

.
1. Dodaj zneutralizowaną eluowaną frakcję do Amicon^® Ultra 15 mL 30 kDa MWCO device.
2. Wirować przez 10 do 20 minut z prędkością 4000 x g w wirniku kubełkowym lub 5000 x g w wirniku o stałym kącie, aż próbka osiągnie pożądane stężenie.