Skalowalna filtracja z przepływem stycznym (TFF) do przetwarzania wektorów wirusowych na potrzeby terapii genowej i produkcji szczepionek

Zastosowanie filtracji z przepływem stycznym podczas produkcji wektorów wirusowych

Produkcja wektorów wirusowych jest kluczowym etapem w terapii genowej i produkcji szczepionek. Sukces zależy od zastosowania odpowiednich technologii w celu zapewnienia zoptymalizowanego, wydajnego i przewidywalnego procesu. Istotną technologią stosowaną w przetwarzaniu wektorów wirusowych jest filtracja z przepływem stycznym (TFF).

Podczas produkcji wektorów wirusowych etap TFF jest wykorzystywany do dwóch ważnych celów:

• Redukcja objętości i diafiltracja przed etapem chromatografii wychwytującej
• Końcowe zatężanie i wymiana na bufor preparatu przed końcową sterylną filtracją

Ostatecznie, TFF zapewnia osiągnięcie docelowego stężenia wektora wirusowego, a produkt końcowy znajduje się w pożądanej matrycy lub buforze substancji leczniczej.

Rozwój i optymalizacja etapów TFF w dalszym przetwarzaniu wymaga uwzględnienia kilku czynników.

Przegląd sekcji

• Najlepsze praktyki podczas projektowania etapu TFF do produkcji wektorów wirusowych
• Rodzaje membran TFF i formatów filtrów stosowanych w oczyszczaniu wektorów wirusowych
• .Strategie kontroli operacyjnej TFF i skalowalność dla rozwoju procesu wektorów wirusowych
• Porównanie kapsułek Pellicon^® i włókien Hollow Fibers dla TFF w produkcji wirusowej terapii genowej
• Powiązane produkty
• Powiązane treści

 

Najlepsze praktyki przy projektowaniu etapu TFF dla produkcji wektorów wirusowych

Projektowanie etapu TFF rozpoczyna się od określenia celu, niezależnie od tego, czy chodzi o osiągnięcie docelowego stężenia produktu w celu wyeliminowania wąskich gardeł w dalszym przetwarzaniu, czy też o przeniesienie preparatu do określonego buforu, a następnie zagęszczenie go na końcu procesu oczyszczania. Kluczowe znaczenie ma wybór projektu systemu i formatu urządzenia, który jest skalowalny; ponadto systemy muszą być scharakteryzowane pod kątem wydajności w skali z odpowiednimi współczynnikami turndown, aby osiągnąć pożądaną wydajność i wydajność w pełnej skali.

Ważną kwestią przy stosowaniu przetwarzania zamkniętego jest to, że system i urządzenie powinny być zaprojektowane dla tego podejścia. Szczególnie pomocne jest posiadanie danych dotyczących wydajności procesu i odzysku dostępnych dla systemów i urządzeń w skali.

Powinien być również znany rozmiar i punkt izoelektryczny docelowej cząsteczki, a także sposób, w jaki kluczowe zmienne procesowe, takie jak temperatura, ścinanie i mieszanie, wpływają na stabilność modalności. Należy również wiedzieć, w jaki sposób modalność oddziałuje z materiałami konstrukcyjnymi, niezależnie od tego, czy membrana jest oparta na polieterosulfonie (PES), czy na regenerowanej celulozie. Zazwyczaj regenerowana celuloza jest preferowana do zastosowań wymagających niskiego wiązania cząsteczek; jednak rodzaj membrany i jej interakcja z modalnością muszą zostać zweryfikowane eksperymentalnie.

Rodzaje membran TFF i formatów filtrów stosowanych w oczyszczaniu wektorów wirusowych

Dostępne są różne rodzaje membran i formatów filtrów dla TFF. Membrany wykonane z PES lub regenerowanej celulozy o masie cząsteczkowej odcięcia 30, 100 lub 300 kDa są ogólnie zalecane do produkcji wektorów wirusowych. Dwa najpopularniejsze formaty filtrów to płaskie kasety lub kapsułki oraz włókna drążone.

Włókna drążone, tradycyjnie stosowane do separacji przemysłowej i biomedycznej, zostały przyjęte do wielu zastosowań biofarmaceutycznych. Są one dostępne ze zmodyfikowanymi włóknami PES i mieszanymi włóknami estrów celulozy. Filtr z pustymi włóknami można wybrać na podstawie liczby lumenów, średnicy i długości. Kasety z płaskim arkuszem, dostępne zarówno z modyfikowanymi membranami PES, jak i regenerowanymi membranami celulozowymi, są specjalnie zaprojektowane do zastosowań biofarmaceutycznych. Są one bardzo wytrzymałe i oferują wydajną wydajność procesu oraz liniową skalowalność w kompaktowym formacie.

Rysunek 1. Pierwszy w swoim rodzaju spiralnie zwijany format Pellicon^® Capsule został zaprojektowany w celu zapewnienia wysokiej wydajności i liniowej skalowalności w konstrukcji typu plug-and-play i jest szczególnie dobrze przystosowany do stosowania w produkcji wektorów wirusowych. Rozmiary porów membrany obejmują 100 kDA i 300 kDa.

Strategie kontroli operacyjnej TFF i skalowalność dla rozwoju procesów wektorów wirusowych

Systemy TFF z kontrolą przenikania są zwykle używane do zastosowań mikrofiltracji (MF), w których wysoce przepuszczalne membrany mogą prowadzić do zbyt wysokich strumieni, które pogarszają lub destabilizują wydajność. W przypadku ściślejszych zastosowań membran ultrafiltracyjnych (UF), takich jak 30 kDa do zatrzymywania przeciwciał, jako alternatywę stosuje się systemy kontroli ciśnienia przezbłonowego (TMP). W przeciwieństwie do tego, wartości graniczne membran stosowane zazwyczaj w produkcji wektorów wirusowych, takich jak wirusy adenoasocjacyjne (AAV) i lentiwirusy (LV), wynoszą 100 i 300 kDa. Otwartość tych membran mieści się pomiędzy bardziej szczelnymi membranami UF i bardziej otwartymi membranami MF.

Przeprowadzono badanie w celu oceny strategii kontroli zarówno TMP, jak i permeatu podczas etapu TFF po klaryfikacji / przed przechwyceniem w procesie produkcji wektorów wirusowych. Zastosowano kapsułkę Pellicon^®. została użyta w eksperymentach wraz ze zmniejszonymi kasetami Pellicon^® XL 50 z membraną Ultracel^® 100 i 300 kDa.

Dla operacji kontroli TMP zastosowano pompę zasilającą i zapewniono swobodny przepływ permeatu (rysunek 1). Do operacji kontroli permeatu zastosowano dwupompowy system TFF, który obejmował pompę zasilającą i pompę permeatu w celu ograniczenia i kontroli przepływu permeatu.

Rysunek 2. Schemat systemów TFF wykorzystanych w tym badaniu: Kontrola TMP (a) i kontrola permeatu z pompą permeatu (b).

Wstępne eksperymenty przeprowadzono w celu scharakteryzowania strumienia permeatu filtrów TFF dla obu strategii sterowania. Następnie przeprowadzono symulacje procesu ultrafiltracji/diafiltracji (UF/DF) w celu oceny średniego strumienia, czasu przetwarzania, TMP, wydajności wirusów i redukcji zanieczyszczeń (Tabela 1). Celem symulacji procesu było czterokrotne (4x) zagęszczenie w trybie wsadowym, diafiltracja z pięcioma diaobjętościami (5 DV) buforu HEPES o stałej objętości, a następnie dwuipółkrotne (2,5x) zagęszczenie w trybie wsadowym dla ogólnego współczynnika stężenia objętościowego (VCF) 10x.

Pełny zestaw metod i wyników eksperymentalnych można znaleźć w nocie aplikacyjnej zatytułowanej: Ocena strategii kontroli operacyjnej TFF i skalowalności dla rozwoju procesu wektorów wirusowych

Tabela 1. Projekt badania.

Opłata za model wirusa		Charakterystyka strumienia		Charakterystyka strumienia permeatu Docelowy strumień początkowy dla przetwarzania
		Symulacje procesu UF1 - 4x DF- 5 DV UF2 - 2.5x		Trendy ciśnienia i strumienia według strategii kontroli Czas, wydajność, redukcja zanieczyszczeń według strategii kontroli Wpływ załadunku paszy według strategii kontroli Wpływ załadunku paszy w zależności od strategii kontroli
Clarified AAV2 Feed				TMP Versus Permeate Control Pellicon®	TMP Versus Permeate Control Pellicon®./sup> Capsule Versus Pellicon® XL 50 Cassette Scaling

Porównanie strategii kontroli TFF

Systemy kontroli TMP są stosunkowo proste, użytkownik musi jedynie ustawić przepływ zasilania i zawór retentatu, aby uzyskać docelowy TMP. Gdy punkt operacyjny jest ustawiony w pobliżu plateau, strumień będzie zbliżony do maksymalnego w każdym punkcie procesu UF/DF, naturalnie zmniejszając się wraz ze stężeniem. Takie podejście może zapewnić najkrótszy czas procesu ze względu na wyższy średni strumień. Jeśli jednak proces staje się niestabilny lub wydajność jest zbyt niska podczas korzystania z kontroli TMP, może być konieczne ograniczenie przepływu permeatu.

Systemy kontroli permeatu mogą ograniczyć przepływ permeatu do pracy znacznie poniżej minimalnego strumienia systemów kontroli TMP i zmniejszyć polaryzację na membranie, co może poprawić wydajność, taką jak redukcja zanieczyszczeń. Jednak systemy kontroli permeatu wymagają dodatkowych elementów sterujących poza tymi stosowanymi w systemach kontroli TMP (pompa permeatu lub zawór sterujący) i mogą powodować wykładniczy wzrost TMP przy strumieniu krytycznym, potencjalnie uniemożliwiając zakończenie pracy z powodu ciśnienia zasilania lub ograniczeń TMP.

W tym badaniu, opartym na porównaniu membran 300 kDa z Pellicon^® Capsule i Pellicon^® XL 50 cassette, operacja kontroli TMP wykazała nawet dwukrotną przewagę strumienia (lub czasu), co może zmniejszyć wymaganą powierzchnię membrany o połowę. Operacja kontroli permeatu wykazała większą przewagę w usuwaniu zanieczyszczeń. Wyniki dotyczące wydajności wirusa były mieszane. Wydajność była podobna dla AAV2 przy użyciu obu strategii kontroli, ale wydajność była ogólnie wyższa w badaniach modelowych z bakteriofagami z kontrolą przenikania.

Skalowanie w ramach rodzin kapsułek i kaset Pellicon^®

Skalowanie kapsułek i kaset zostało zademonstrowane poprzez porównanie strumienia, profilu TMP, wydajności i redukcji zanieczyszczeń przy użyciu modelowej paszy wirusowej i AAV2. Rodzina filtrów TFF Pellicon^® umożliwia liniowe skalowanie w szerokim zakresie wielkości partii paszy. Tabela 2 przedstawia przykład obsługi wsadów TFF o objętości do 2000 litrów za pomocą jednorazowych kapsułek Pellicon^®. Jeśli wymagane jest skalowanie do większych, wielorazowych partii, można płynnie przejść na kasety Pellicon^® 2 z tą samą kombinacją membrany i sita.

Tabela 2. Zwiększanie skali przy użyciu filtrów TFF Pellicon^®. Przykład oparty na danych z noty aplikacyjnej (4x/5 DV/2,5x), z wyjątkiem przypadków, w których szacunki zostały ekstrapolowane (*).

			Rozmiar partii (L) przy załadunku (L/m2)
Filtr	Obszar całkowity (m2)	System TFF	35	120	150
Pellicon® XL 50 Cassette	0.0050	Cogent® Lab System	0.18	0.60	0.75
Pellicon® Capsule	0.1	Cogent® Lab System	3.5	12	15
	0.5	Mobius® TF2S System	17.5	60	75
	1	Mobius® TF2S System	35	120	150
	1.5	Mobius® TF2S System	52.5	180	225
	3	Mobius® TF2S System	105	360	450
	9	Mobius® TFF 80 System	315	1080	1350
	13.5	Mobius® TFF 80 System	472.5	1620	2025
Pellicon® 2 Cassette	80	System wagi procesowej Cogent®	2800	9600	12000
Czas procesu kontroli permeatu (h)			1.8	6.2*	7.7*
Czas procesu kontroli TMP			0.9	4.3	6.1*

Porównanie Pellicon^® Capsules i Hollow Fibers dla TFF w produkcji wirusowej terapii genowej

W poniższym badaniu oceniono wydajność filtra podczas etapu TFF1 przy użyciu modelowej paszy wirusowej. W badaniu tym oceniono kapsułki Pellicon^® Capsules i ich filtr skalowalny, kasety Pellicon^® XL 50, i porównano je pod względem wydajności z dwoma modułami z pustych włókien, HF-A (0,5 mm/60 cm) i HF-B (0,5 mm/20 cm).

Pełny zestaw metod i wyników eksperymentalnych można znaleźć w nocie aplikacyjnej zatytułowanej: Pellicon^® Capsules versus Hollow Fibers for Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF) in Viral Gene Therapy Manufacturing

Sizing Scenarios and Process Impact Analysis<

Wyniki symulacji procesu kontroli przenikania 300 kDa zostały zastosowane do stworzenia dwóch teoretycznych scenariuszy doboru rozmiaru przy użyciu kapsułki Pellicon^® i pustych włókien:

• Scenariusz 1 zakłada takie samo obciążenie dla wszystkich filtrów. Ten scenariusz porównuje czas pracy i maksymalny możliwy VCF dla partii 100 l przy obciążeniu 35 l/m².
• Scenariusz 2 ogranicza czas wymagany do zakończenia procesu TFF. Ten scenariusz porównuje wymagany obszar filtracji i maksymalny możliwy VCF dla przetwarzania partii 1000 l w ciągu 4 godzin, co wymaga zmiennego obciążenia.

Wyniki ze scenariusza 1 pokazano w Tabeli 3. Przy użyciu tego samego obciążenia (35 l/m²), kapsułka Pellicon^® działa 2,9 razy szybciej niż włókno puste HF-A przy tej samej znormalizowanej prędkości przepływu krzyżowego. Kapsuła jest nadal 1,7x szybsza, nawet gdy światłowód HF-B wykorzystuje potrójną szybkość przepływu krzyżowego kapsuły. Chociaż HF-B był w stanie zaoszczędzić trochę czasu w porównaniu do HF-A, wyższa szybkość przepływu krzyżowego zmniejsza maksymalny możliwy VCF systemu z pustym włóknem o współczynnik ~ 4x.

Tabela 3. Modelowanie scenariusza w skali 100 l dla przetwarzania partii TFF1 przy obciążeniu 35 l/m² w oparciu o dane strumienia z badania symulacyjnego 300 kDa.

Scenariusz I: Partia 100 l, 35 l/m2, 300 kDA, kontrola permeatu
Parametr	Pellicon® Capsule 5 LMM	HF-A 5 LMM	HF-B 15 LMM
Powierzchnia (m2)	2.9	2.9	2.9
Czas biegu (godz.)	1.9	5.5	3.3
Czas działania znormalizowany do kapsułki	1.0	2.9	1.7
Max VCF	33	33	8.3
Przepływ (L/min)	15.8	14.8	43.8
System TFF firmy Mobius®	TF2S	TF2S	Przepływ zbyt wysoki
Uwaga: Obliczony obszar jest przed zastosowaniem współczynnika bezpieczeństwa. Maksymalny współczynnik VCF jest teoretycznie oparty na minimalnej objętości recyrkulacji systemu, która zależy od natężenia przepływu krzyżowego i wynikającego z niego orurowania. System TFF Mobius® zapewnia kontrolę permeatu za pomocą automatycznego zaworu.

Wyniki scenariusza 2 przedstawiono w Tabeli 4. Aby uzyskać ten sam czas procesu (4 godziny), kapsułka Pellicon^® wymagała tylko 35% obszaru filtracji i 37% przepływu zasilającego modułu z włókna kanalikowego, gdy filtry działają przy tej samej szybkości przepływu krzyżowego - tj. w porównaniu do przypadku HF-A. Jeśli szybkość przepływu krzyżowego włókna pustego zostanie potrojona w celu zwiększenia jego strumienia (przypadek HF-B), kapsułka wymagała tylko 58% powierzchni filtracji włókna pustego i 21% jego przepływu zasilającego. Należy również zauważyć, że wyższy przepływ zasilający systemu włókien kanalikowych zmniejsza maksymalny możliwy VCF ~4x.

Tabela 4. Modelowanie scenariusza przetwarzania partii TFF1 w skali 1000 l w ciągu 4 godzin w oparciu o dane strumienia z badania symulacyjnego 300 kDa.

Scenariusz II: partia 100 l, proces 4-godzinny, 300 kDA, kontrola permeatu
Parametr	Pellicon® Capsule 5 LMM	HF-A 5 LMM	HF-B 15 LMM
Loading (L/m2)	73.2	25.4	42.3
Powierzchnia (m2)	13.7	39.4	23.7
Powierzchnia znormalizowana do kapsułki	1.0	2.9	1.7
Max VCF	40.0	22.2	11.1
Przepływ (L/min)	75.7	204.6	362.4
System TFF firmy Mobius®	TFF 80	Przepływ zbyt wysoki	Przepływ zbyt wysoki
Uwaga: Obliczony obszar jest przed zastosowaniem współczynnika bezpieczeństwa. Maksymalny współczynnik VCF jest teoretycznie oparty na minimalnej objętości recyrkulacji systemu, która zależy od natężenia przepływu krzyżowego i wynikającego z niego orurowania. System TFF Mobius® zapewnia kontrolę permeatu za pomocą automatycznego zaworu.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki badania wykazały, że moduły z pustymi włóknami zapewniają niższy strumień przy danym ścinaniu, w wyniku czego wymagana jest znacznie większa powierzchnia membrany lub czas przetwarzania w porównaniu do kapsułek Pellicon^®. Podczas gdy szybkość przepływu krzyżowego pustych włókien została zwiększona w celu osiągnięcia wyższego tempa produkcji, strumień pozostał niższy niż w przypadku kapsułek Pellicon^®, a powstały system może być ograniczony w osiąganiu celów wysokiego stężenia.

W przeciwieństwie do tego, kapsułki Pellicon^® Capsules osiągnęły wyższy i bardziej stabilny strumień niż puste włókna, co skutkowało bardziej wydajnym procesem TFF, zapewniając jednocześnie porównywalną wydajność wirusów. Uzyskany system jest również mniejszy, co umożliwia osiągnięcie wyższego stężenia docelowego.

Related Content

Nota aplikacyjna: Skalowalne oczyszczanie plazmidowego DNA: Strategies and Considerations for Vaccine and Gene Therapy Manufacturing
Technical Brief: Evaluation of TFF Operating Control Strategies and Scalability for Viral Vector Process Development
Nota aplikacyjna: Pellicon^® Capsules versus Hollow Fibers for Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF) in Viral Gene Therapy Manufacturing
Nota techniczna: Filtracja z przepływem stycznym (UF/DF) plazmidowego DNA
Przegląd produktów: Ultrafiltracja/diafiltracja (UF/DF) wirusów adenowirusowych (AAV) za pomocą kapsułek Pellicon^® i kaset Pellicon^® XL 50
Skrypta podcastu: Wywiad - Czysta ignorancja? Pomyśl jeszcze raz: przełamywanie percepcji ścinania w produkcji wektorów wirusowych

Request Information

Jeśli jesteś zainteresowany którąkolwiek z naszych platform upstream powyżej, wypełnij i prześlij poniższy formularz internetowy, aby uzyskać więcej informacji i rozpocząć wprowadzanie terapii genowej w życie.

Pola oznaczone * są obowiązkowe.