Bromek etydyny

Co to jest bromek etydyny?

Bromek etydyny (EtBr) jest fluorescencyjnym barwnikiem szeroko stosowanym w badaniach biologii molekularnej. Na początku był stosowany jako trypanocyd weterynaryjny.¹⁴ Jest to związek mutagenny, który interkaluje dwuniciowe DNA i RNA.^1,10 Fluorescencja EtBr wzrasta 21-krotnie po związaniu z dwuniciowym RNA, 25-krotnie po związaniu dwuniciowego DNA (chociaż histony blokują wiązanie EtBr z DNA). Bromek etydyny był stosowany w wielu testach fluorymetrycznych dla kwasów nukleinowych.^15,16,17 Wykazano, że wiąże się z jednoniciowym DNA (choć nie tak silnie)² i trójniciowym DNA.¹⁸ Ze względu na wiązanie z DNA, EtBr jest silnym inhibitorem polimerazy DNA.⁴

• Molecular Biology-grade Powder (Product No. E7637) jest odpowiedni do stosowania w elektroforezie żelowej i procedurach izolacji DNA.
• Roztwór wodny (10 mg/ml) (Nr produktu  E1510) jest odpowiedni do stosowania w elektroforezie żelowej i procedurach izolacji DNA.
• Roztwór wodny klasy biologii molekularnej (500 mg/ml) (Nr produktu. E1385) jest odpowiedni do stosowania w elektroforezie żelowej.

Synonimy: bromek 3,8-diamino-5-etylo-6-fenylofenantrydyniowy; bromek 2,7-diamino-10-etylo-9-fenylofenantrydyniowy; bromek homidium; Dromilac; EtBr

Szczegóły produktu bromku etydyny

Wygląd: Czerwony do fioletowego proszek
Wzór cząsteczkowy: C₂₁H₂₀N₃Br
Masa cząsteczkowa: 394,3
Temperatura topnienia: 255-266 °C z rozkładem^1,2

Dane spektralne:
Absorbancja UV/Vis:
Maksima przy 210 nm, E^mM = 0.20-0,5; 285 nm, E^mM = 5,0-10,0; 316 nm, E^mM = 50,0; 343 nm, E^mM = 40.0 (woda)³
Opublikowane widmo absorpcji (metanol) z λ_max przy 296 nm i
525 nm¹
λ_max = 475 nm, E^mM = 5.76 (0,66 M bufor glicynowy)⁴

Wpływ rozpuszczalnika na absorbancję:
λmax = 480 nm (woda); 515 (glicerol); 520 nm (metanol): 520 nm (aceton); 532 nm (etanol); 535 (DMSO) i 540 nm (pirydyna).5 Maksimum absorbancji względem wody jest przesunięte ku czerwieni do dłuższych fal po związaniu z kwasami nukleinowymi.6,7

Fluorescencja
Długości fal wzbudzenia/emisji podane dla kompleksu EtBr-kwas nukleinowy:
Ex przy 526 nm, Em przy 605 nm (wodny)8
Ex przy 360 nm, Em przy 590 nm (w PBS)9
Ex przy 525 nm, Em przy 600 nm (10 mM TBE, pH 8.0)10
Ex (absorpcja) przy 510 nm, Em przy 590 nm.11

Ex (absorpcja) przy 482 nm (niebiesko-zielony), Em przy 616 nm (czerwono-pomarańczowy).12 Wydajność fluorescencji EtBr wzrasta wraz ze spadkiem polarności rozpuszczalnika.13

Przechowywanie: Stały proszek wykazał minimalne zmiany po dwóch latach przechowywania w temperaturze pokojowej, chroniony przed światłem.

Zalecaną ostateczną metodą utylizacji jest spalanie, jak omówiono w Karcie Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej.23Przetwarzanie roztworów za pomocą żywicy Rohm and Haas Amberlite XAD-16 okazało się skuteczne do granicy wykrywalności, a żaden z całkowicie odkażonych roztworów nie okazał się mutagenny.24,25 Oferujemy XAD-16 jako produkt luzem, a także kilka produktów, które adsorbują barwnik w celu łatwiejszej utylizacji. Zobacz wkłady Rezorian A161 (nr produktu  57611 lub 57610) i Extractor™ do dekontaminacji EtBr (nr produktu. Z361569). Wkład Rezorian A161 o pojemności 5 ml może być używany do oczyszczania ponad 16 litrów roztworu (0,5 mg/litr EtBr) przed przebiciem barwnika. Wkład luer lock może być używany z rurkami o średnicy wewnętrznej 4 mm, strzykawkami lub niskociśnieniowymi systemami chromatograficznymi. Ekstraktor™ do odkażania EtBr może przetwarzać do 10 litrów roztworu (0,5 mg/l EtBr). Zaproponowano również inne metody utylizacji wodnych roztworów EtBr.26,27,28

Powiązane produkty

Błękit metylenowy (produkt nr  M4159) został zgłoszony jako alternatywny barwnik.19Pomarańczowy homodimer tiazolu (monomer = produkt nr  390062) został uznany za niemutagenny, ale przydatny do wykrywania DNA w żelach agarozowych.20

Do stosowania w badaniach komórkowych, dihydroetydyna (nr produktu  D7008), znana również jako hydroetydyna, jest możliwą alternatywą. Jest to zredukowana forma barwnika i jest przekształcana (odwodorniana) wewnątrz komórki do kationu etydyny, który następnie interkaluje do DNA.21,22

Przygotowanie bromku etydyny

W temperaturze pokojowej EtBr rozpuszcza się w wodzie w stężeniu 10 mg/ml, dając czerwony roztwór.2 Powinien być rozpuszczalny do 20 mg/ml w wodzie lub do 2 mg/ml w etanolu.1 Jest rozpuszczalny w 1 części w 750 częściach chloroformu.3

Roztwory magazynowe EtBr w wodzie lub PBS są stabilne przez co najmniej dwa lata w temperaturze pokojowej, jeśli są chronione przed światłem.11

Barwienie elektroforetyczne bromkiem etydyny

Użycie w barwieniu elektroforetycznym6

1. Barwnik jest zwykle dodawany do żelu i buforu do elektroforezy w stężeniu 0,5 mg/ml. Uwaga: Ruchliwość elektroforetyczna liniowego dwuniciowego DNA jest zmniejszona o około 15% w obecności barwnika.
2. Aby wybarwić po uruchomieniu żelu, zanurz żel w buforze do elektroforezy lub wodzie zawierającej EtBr (0,5 mg / ml) na 30-45 minut w temperaturze pokojowej.
3. Barwienie jest opcjonalne. Wykrywanie małych ilości (10 ng) DNA jest łatwiejsze, jeśli fluorescencja tła spowodowana przez niezwiązany EtBr jest zmniejszona przez namoczenie zabarwionego żelu w wodzie lub 1 mM MgSO4 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

.

Referencje

1. Green, F. 1990 . Sigma-Aldrich Handbook of Stains, Dyes and Indicators Aldrich Chemical Co . p. 318..

2. Internal quality control - molecular biology laboratories..

3. 1996 . "Merck Index . 12th ed., #4767.

4. Elliott W. 1963. The effects of antimicrobial agents on deoxyribonucleic acid polymerase. 86(3):562-567. https://doi.org/10.1042/bj0860562

5. Olmsted J, Kearns DR. 1977. Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids. Biochemistry. 16(16):3647-3654. https://doi.org/10.1021/bi00635a022

6. Sambrook, Jea. 1989 . Molecular Cloning: A Laboratory Manual . 2nd ed, p 6.15, 6.44 . Cold Spring Harbor Laboratory.

7. Le Pecq J. Use of Ethidium Bromide for Separation and Determination of Nucleic Acids of Various Conformational Forms and Measurement of Their Associated Enzymes.41-86. https://doi.org/10.1002/9780470110393.ch2

8. "Bechtol, Kea. December 1994 . American Biotechnology Lab . p. 8.

9. Boer G. 1975. A simplified microassay of DNA and RNA using ethidium bromide. Analytical Biochemistry. 65(1-2):225-231. https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90507-2

10. Severini A, Richard Morgan A. 1991. An assay for proteinases and their inhibitors based on DNA/ethidium bromide fluorescence. Analytical Biochemistry. 193(1):83-89. https://doi.org/10.1016/0003-2697(91)90046-v

11. Crary, B, Boyrsenko, M. 1986 . Biotechniques . 4, 98-101.

12. Givan, A. Flow Cytometry: First Principles . p. 104 and p. 64,. Wiley-Liss, NY :

13. 1974 . Methods in Enzymology . 32, 239.

14. Watkins TI. 1952. 585. Trypanocides of the phenanthridine series. Part I. The effect of changing the quaternary grouping in dimidium bromide. J. Chem. Soc..3059. https://doi.org/10.1039/jr9520003059

15. Moore SP, Sutherland BM. 1985. A densitometric nondestructive microassay for DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 144(1):15-19. https://doi.org/10.1016/0003-2697(85)90077-6

16. El-Hamalawi AA, Stuart Thompson J, Barker GR. 1975. The fluorometric determination of nucleic acids in pea seeds by use of ethidium bromide complexes. Analytical Biochemistry. 67(2):384-391. https://doi.org/10.1016/0003-2697(75)90309-7

17. Karsten U, Wollenberger A. 1977. Improvements in the ethidium bromide method for direct fluorometric estimation of DNA and RNA in cell and tissue homogenates. Analytical Biochemistry. 77(2):464-470. https://doi.org/10.1016/0003-2697(77)90259-7

18. Scaria PV, Shafer RH. 1991. Binding of ethidium bromide to a DNA triple helix. Evidence for intercalation.. Journal of Biological Chemistry. 266(9):5417-5423. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(19)67611-8

19. 1989 . Technique: A Journal of Methods in Cell and Molec. Biol . 1, 183-187 . Philadelphia, PA : Saunders Scientific Publications.

20. Wilke, Wea. 1994 . Mod. Pathol . 7(3):385-387 .

21. Quantitative Fluorescent Microassay for Identification of Antiproliferative Compounds2. https://doi.org/10.1093/jnci/77.6.1235

22. Budd SL, Castilho RF, Nicholls DG. 1997. Mitochondrial membrane potential and hydroethidine-monitored superoxide generation in cultured cerebellar granule cells. 415(1):21-24. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(97)01088-0

23. Corresponding Safety Data Sheet (SDS)..

24. Joshua H. 1986 . Quantitative adsorption of ethidium bromide from aqueous solution by macroreticular resins . BioTechniques . 4 207–208.

25. Lunn G, Sansone EB. 1991. Decontamination of Aqueous Solutions of Biological Stains. Biotechnic & Histochemistry. 66(6):307-315. https://doi.org/10.3109/10520299109109992

26. Lunn G, Sansone EB. 1987. Ethidium bromide: Destruction and decontamination of solutions. Analytical Biochemistry. 162(2):453-458. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90419-2

27. 1992 . Communications from M.A. Armour . University of Alberta, Edmonton, Canada – prior to presentation at First Asian Symposium on Academic Activity for Water Treatment Tokyo";

28. ZOCHER R, BILLICH A, KELLER U, MESSNER P. 1988. Destruction of Ethidium Bromide in Solution by Ozonolysis. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 369(2):1191-1194. https://doi.org/10.1515/bchm3.1988.369.2.1191