Uzyskanie funkcjonalnych komórek progenitorowych oligodendrocytów (OPC) z linii ludzkich nerwowych komórek macierzystych

Christine Chen, Michael Moeller, Anna Abai, Nick Asbrock and Vi Chu

Merck, Bioscience Division, Temecula, CA, USA

Ludzkie neuronalne komórki macierzyste (hNSC) były intensywnie badane pod kątem ich potencjału terapeutycznego w chorobach neurodegeneracyjnych i urazach kręgosłupa. W zależności od mikrośrodowiska i bodźców wzrostowych, komórki te mogą ulegać neurogenezie i zastępować uszkodzone komórki. W ośrodkowym układzie nerwowym sama neurogeneza nie wystarcza do naprawy uszkodzeń neuronów. Funkcjonalne neurony muszą być chronione przez osłonkę mielinową, która jest syntetyzowana przez oligodendrocyty, aby skutecznie dostarczać potencjał czynnościowy na duże odległości. Zrozumienie rozwoju oligodendrocytów jest niezbędnym kamieniem milowym w kierunku opracowania klinicznych i farmaceutycznych metod leczenia patologii neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane.

Ogólnie rzecz biorąc, hNSC generują niską i niespójną liczbę oligodendrocytów in vitro. Aby opracować modelowy system dla hodowanych oligodendrocytów, trzy linie neuronalnych komórek macierzystych zostały przetestowane pod kątem ich zdolności do różnicowania się w komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC). Dwie z linii komórkowych zareagowały na reżim różnicowania, który obejmował małe cząsteczki i czynniki wzrostu, PDGF, NT3, hormon tarczycy (T3) i FGF2. Obie linie komórkowe wykazywały od 30 do 50% wzrost populacji OPC mierzony barwieniem immunofluorescencyjnym dla wielu markerów oligodendrogleju: NG2, O4, Sox10 i GalC. Te OPC mogą być dalej różnicowane do dojrzałych oligodendrocytów w warunkach wolnych od mitogenów. Nasze dane pokazują, że komórki te zachowują stabilne cechy OPC przez co najmniej trzy pasaże i wyrażają wiele markerów oligodendrocytów po różnicowaniu. Korzystając z systemu współhodowli, pokazujemy, że te ludzkie OPC rozwinęły się w dojrzałe oligodendrocyty, które wytwarzały MBP wokół aksonu w pierwotnych hodowlach neuronów szczurów.

Metody

Hodowla ludzkich neuronalnych komórek macierzystych

.

Dwie unieśmiertelnione linie ludzkich neuronalnych komórek macierzystych, ReNcell™ VM (SCC008) i ReNcell™ CX (SCC007) zostały wykorzystane wraz z linią ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych ENStem-A™ pochodzących z ESC (SCR055). Neuronalne komórki macierzyste hodowano w postaci monowarstw przy użyciu pożywki podtrzymującej ReNcell (SCM005) świeżo uzupełnionej 20 ng/ml FGF-2 lub pożywki ekspansyjnej ENStem™-A (SCM004) świeżo uzupełnionej 20 ng/ml FGF-2 i 2 mM glutaminy. Linie ReNcell hodowano na kolbach pokrytych lamininą 20 μg/mL (L2020), podczas gdy komórki hESC-NPC hodowano na kolbach pokrytych Matrigelem. Wszystkie komórki utrzymywano w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO₂, 37°C, pasażowano enzymatycznie roztworem Accutase^® (A6964) i wysiewano w gęstości 1X10⁵/cm² do osiągnięcia 70-80% konfluencji.

Różnicowanie i dojrzewanie oligodendrocytów

.Ludzkie nerwowe komórki macierzyste zebrano i ponownie umieszczono w odpowiednich pożywkach wzrostowych w ilości 5 x 10⁵ komórek/ml na płytkach o bardzo niskiej przyczepności (CLS3471) w celu utworzenia neurosfer. Neurosfery poddano działaniu kwasu retinowego (R2625), a następnie przeniesiono do pożywki wzbogacającej oligodendrocyty (OEM: DMEM/F12 z 1X NEAA, 2 mM glutaminą, suplementem pożywki N21, koktajlem czynników wzrostu (hormon tarczycy (T3, T5516); rekombinowany ludzki PDGF-AA (SRP3268), rekombinowana ludzka neurotrofina-3 (N1905) i rekombinowany ludzki podstawowy FGF2 (F0291)). Neurosfery kontynuowano hodować w OEM przez kilka pasaży przed umieszczeniem ich na kolbie pokrytej Matrigelem w celu ekspansji w pożywce do ekspansji OPC (SCM107). Gęstość wysiewu wzbogaconych hodowli OPC wynosiła 1-2 x 10⁴ komórek/cm².

Charakterystyka komórek progenitorowych oligodendrocytów

10⁴ komórek/cm² OPC umieszczono na 0.1% poli-L-ornityny (P4957) i 10 μg/mL lamininy (L2020) pokrytych Millicell^® EZ SLIDES (PEZGS0416) lub kolbach T25 i hodowano przez noc przed przełączeniem na podłoże bez czynnika wzrostu. Oligodendrocyty pozostawiono do dojrzewania na 2 do 3 tygodni przed utrwaleniem 2% paraformaldehydem lub lizą w celu ekstrakcji RNA.

Proliferujące OPC scharakteryzowano za pomocą przeciwciał specyficznych dla wczesnych markerów oligodendrocytów, w tym anty-Sox10 (AB5727, 1:200), anty-GN2 (AB5320, 1:200), anty-Olig-2 (AB9610, 1:100) i anty-O4 (MAB345, 1. 50), podczas gdy dwutygodniowe zróżnicowane oligodendrocyty były badane z użyciem przeciwciał anty-O4 (MAB345, 1. 50):50), podczas gdy dwutygodniowe zróżnicowane oligodendrocyty scharakteryzowano przeciwciałami do pośrednich i późnych markerów oligodendrocytów, w tym anty-GalC (MAB342, 1:200), anty-PLP-1/DM20 (MAB388, 1:100), anty-MBP (05-675, 1:25), anty-MOG (MAB5680, 1:25), anty-CNPase (1:100) i anty-RIP (1:25). Astrocyty znakowano anty-GFAP (MAB3402, 1:250), a neurony znakowano anty-bIII tubuliną (MAB1637, 1:100) lub anty-MAP2 (MAB3418, 1:200).

In Vitro Myelination Assay

Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm były traktowane kwasem 1N HCl (H1758) przez noc, płukane Milli-Q^® H₂O (MILLIQ), a następnie sterylizowane w autoklawie. Szkiełka nakrywkowe wysuszono na powietrzu przed pokryciem 0,1% poli-L-lizyną (P8920) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przemyto sterylną wodą destylowaną. 1 x 10⁵ pierwotnych neuronów hipokampa szczura E19 (R886N-10) umieszczono na szkiełku nakrywkowym pokrytym poli-L-lizyną w każdej studzience 4-dołkowej płytki w pożywce Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) z 10% inaktywowaną termicznie surowicą końską. 24 do 48 godzin po umieszczeniu na płytce, komórki transfekowano 1 μg plazmidu pCAG-GFP zgodnie z protokołem producenta. 24 godziny po transfekcji około 10-20% pierwotnych neuronów było GFP-dodatnich. Cztery dni po transfekcji, 2 x 10⁴ ludzkich OPC wysiano na płytkę, a pożywkę do hodowli neuronów zastąpiono pożywką do spontanicznego różnicowania ludzkich OPC (SCM106). Ko-kulturę ludzkich OPC i szczurzych neuronów pierwotnych pozostawiono w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych z 5% CO₂ przez 21 dni ze zmianą pożywki co 2-3 dni.

Wyniki

Trzy linie neuronalnych komórek progenitorowych zostały przetestowane pod kątem wzbogacania OPC. Wśród nich linia NPC pochodząca z ESC ENStem-A i unieśmiertelniona linia ludzkich płodowych NSC (ReNcell VM) zawierały znaczną liczbę A2B5- i GalC-dodatnich komórek w hodowli OEM. W przeciwieństwie do tego, unieśmiertelniona linia ludzkich korowych NSC (ReNcell CX) nie wykazała znaczącej różnicy w ekspresji markerów między macierzystą linią komórek NSC a warunkami ukierunkowanego różnicowania (dane nie pokazane).

Rysunek 1 pokazuje ilościowe i reprezentatywne obrazy ludzkich NSC hodowanych w oryginalnej pożywce (macierzystej) lub w pożywce wzbogacającej oligodendrocyty (OEM). Komórki ENStem-A (Rysunek 1A i B) wykazywały umiarkowany wzrost markera progenitorowego O2A, A2B5 i 3-krotny wzrost markera pośredniego oligodendrocytów, GalC w hodowli OEM. Natomiast komórki ReNcell VM (Rys. 1C i D) hodowane w OEM wykazały ponad 6-krotny wzrost ekspresji A2B5 i mniej niż 2-krotny wzrost ekspresji GalC. Ilustruje to, że nawet po poddaniu tej samej procedurze wzbogacania, każda linia NSC reaguje inaczej na małe cząsteczki i czynniki wzrostu.

Rysunek 1. OPC uzyskane z linii ludzkich neuronalnych komórek macierzystych. Ilościowy pomiar komórek A2B5- lub GalC-pozytywnych w (A) ENStem-A lub (C) ReNcell VM w standardowej pożywce (macierzystej) lub pożywce wzbogacającej oligodendrocyty (OEM). Dane obliczono na podstawie trzech losowo wybranych pól i przedstawiono jako średnią z błędem standardowym. (B) i (D) przedstawiają reprezentatywne obrazy dla (A) i (C). Obrazy wykonano przy użyciu 20-krotnego obiektywu. A2B5-Parental (B, D, u góry po lewej); A2B5-OEM (B, D, u góry po prawej); Gal C-Parental (B, D, lewy dolny róg); Gal-C-OEM (B, D, prawy dolny róg).

Aby zbadać, czy OPC mogą być stabilnie utrzymywane w pożywce wzbogacającej oligodendrocyty, monitorowaliśmy tempo proliferacji komórek poprzez pomiar czasu podwojenia. Komórki podwajały się co 48 godzin przez co najmniej 7 tygodni w hodowli (Rysunek 2A), a dwubiegunowa morfologia sugerowała, że komórki te znajdowały się na etapie różnicowania progenitorów neuronalnych/oligodendrocytów.

Rysunek 2. Obrazy jasnego pola proliferujących ludzkich OPC 24 godziny po rozmrożeniu (A) i po tygodniu w hodowli (B). Ludzkie OPC podwajają się co 48 godzin (C).

Następnie zbadaliśmy komórki OPC pod kątem ekspresji białek poprzez barwienie immunofluorescencyjne między pasażem 3 a pasażem 5. Zaobserwowaliśmy wysoką liczbę komórek wykazujących ekspresję białek Olig2 (92%, Rysunek 3A), Sox10 (81%, Rysunek 3B), O4 (82%, Rys. 3C), NG2 (64%, Rys. 3D) i GalC (80%, Rys. 3E). Po 2 tygodniach spontanicznego różnicowania komórki przekształciły się w 50-70% neuronów MAP2- lub bIII-tubuliny-dodatnich (Rys. 4) i mniej niż 5% astrocytów GFAP-dodatnich (Rys. 4). Od 30 do 50% komórek wykazywało silną ekspresję markerów oligodendrocytów pośrednich i późnych MBP, PLP-1, MOG, RIP, GalC i NG2 (Rysunek 4).

Rysunek 3. Charakterystyka komórek progenitorowych oligodendrocytów. Ludzkie OPC wyrażają markery wczesnych oligodendrocytów Olig2, Sox10, O4, NG2 i GalC. Komórki progenitorowe oligodendrocytów umieszczono w ilości 10⁴ komórek/cm² na 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-L-ornityną i lamininą.

Rysunek 4. Charakterystyka dojrzałych oligodendrocytów. Po 2 tygodniach spontanicznego różnicowania, ludzkie OPC generują około 30% dojrzałych oligodendrocytów (MBP, MOG, PLP, RLP, RIP) i ~50% neuronów (Tubulina, MAP2). Ludzkie OPC umieszczono w ilości 10⁴ komórek/cm² na 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-L-ornityną i lamininą w podłożu Human OPC Expansion Complete Media. Dwadzieścia cztery godziny po wysianiu, spontaniczne różnicowanie zostało zainicjowane przez wymianę mediów z Human OPC Spontaneous Differentiation Complete Media.

Pierwotne neurony szczura wyizolowane z embrionalnego hipokampa to głównie neurony piramidalne, które mają charakterystyczną morfologię złożoną z pojedynczych aksonów i wielu dendrytów. Aby ułatwić identyfikację pierwotnych neuronów szczura, wprowadzono białko zielonej fluorescencji (GFP) poprzez przejściową transfekcję. 10%-20% komórek zostało pomyślnie transfekowanych, a ekspresja GFP była stabilna przez cały okres obserwacji. Pochodzące z ludzkich komórek ES komórki OPC dodano do pierwotnej hodowli neuronów szczura w stosunku 1:5. Trzy tygodnie po zainicjowaniu kokultury przeanalizowaliśmy względny stopień mielinizacji za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Podstawowe białko mieliny (MBP) jest głównym składnikiem osłonki mielinowej. W przypadku braku ludzkich OPC, pierwotne hodowle neuronów szczura wykazywały niewielkie lub żadne zabarwienie MBP (Rysunek 5A). W przeciwieństwie do tego, w kokulturze zawierającej aksony znakowane GFP i ludzkie OPC, zaobserwowano znaczące barwienie MBP (Rysunek 5B). Ekspresja MBP kolokalizowała z jądrami, dostarczając dowodów na to, że MBP ulega ekspresji z ludzkich OPC. Dane te sugerują, że w obecności dojrzałych lub rozwijających się aksonów, ludzkie OPC pochodzące z komórek ES mogą być dalej dojrzewane do funkcjonalnych oligodendrocytów, które są zdolne do wytwarzania mieliny w celu ochrony aksonów.

Rysunek 5. Test mielinizacji In-Vitro. Ludzkie OPC pochodzące z komórek ES (Human Nuclei+) mielinizują neurony (MBP+), gdy są współhodowane z pierwotnymi neuronami szczura (A, B, C).

Wnioski

Opracowaliśmy stabilną linię komórek macierzystych, która może utrzymać wysoki odsetek progenitorów oligodendrocytów w hodowli i która może potencjalnie dawać funkcjonalne, produkujące mielinę oligodendrocyty po spontanicznym różnicowaniu. Komórki te mogą być również wykorzystywane do badania cząsteczek, które promują lub hamują przeżycie i różnicowanie ludzkich OPC. Nasze obecne wysiłki mają na celu zidentyfikowanie tych cząsteczek, które zwiększyłyby różnicowanie OPC. To wygodne, niezawodne źródło oligodendrocytów może pomóc w rozwoju badań nad terapiami neurodegeneracyjnymi w chorobach takich jak stwardnienie rozsiane.

FAQ

Na jaką kolbę do hodowli tkankowej powinienem rozmrozić komórki?

Jedną fiolkę komórek należy rozmrozić i umieścić na kolbie T25 pokrytej Matrigelem. Nie zaleca się rozmrażania do kolby o większym rozmiarze.

Komórki są dostarczane w którym przejściu?

Komórki zostały zbankowane w 3. pasażu i mogą być dwukrotnie namnażane. Komórki nie powinny być używane po przejściu 6.

Ile razy mogę przejść przez komórki?

Komórki mogą być pasażowane dwukrotnie. Po rozmrożeniu komórki osiągają pasaż 4. Po dodatkowych dwóch pasażach komórki osiągają pasaż 6. Komórki nie powinny być rozszerzane poza pasaż 6.

Przy jakiej konfluencji powinienem pasażować komórki?

Komórki powinny być pasażowane, gdy osiągną 80% konfluencji. NIE zaleca się pasażowania komórek, gdy osiągną 100% konfluencji.

Jaki jest optymalny współczynnik podziału?

Optymalna gęstość wysiewu wynosi od 2 do 4 x 10⁴/cm². Odpowiada to 500 000 komórek na odpowiednio pokrytej kolbie T25 lub podziałowi 1:3 do 1:5.

Czy mogę zamrozić swoje komórki?

Nie, nie zalecamy zamrażania komórek. Nie możemy zagwarantować wydajności komórek, które zostały zamrożone przez indywidualnych użytkowników.

Czy mogę zamiast tego użyć moich nośników?

Podłoże do ekspansji ludzkich OPC zostało zoptymalizowane specjalnie dla naszych ludzkich OPC. Inne podłoża nie były testowane. Jeśli używane są inne podłoża hodowlane, komórki powinny zostać dokładnie scharakteryzowane przez użytkownika, aby upewnić się, że zachowują prawidłowy fenotyp i charakterystykę barwienia.

Czy mogę używać zestawów Human OPC Expansion lub Differentiation Media do ekspansji, hodowli i różnicowania oligodendrocytów uzyskanych od innego dostawcy lub wyizolowanych samodzielnie?

Nie. Te pożywki zostały zoptymalizowane specjalnie dla naszych ludzkich OPC. Inne typy komórek nie zostały przetestowane. Nie wierzymy, że komórki uzyskane z innych źródeł lub bezpośrednio wyizolowane z tkanek mózgu będą zachowywać się podobnie w systemie pożywek.

Czy mogę użyć własnych czynników wzrostu do różnicowania?

Czynniki wzrostu inne niż te dostarczone w zestawie nie zostały przetestowane. Jeśli użytkownik rozważa zastosowanie innych czynników wzrostu, zaleca się użycie dostarczonego zestawu nośników jako pozytywnej kontroli w celu porównania wpływu innych czynników wzrostu i cytokin na ekspansję i różnicowanie ludzkich OPC.

Czy mogę użyć innego ECM do powlekania?