Hodowla ludzkich komórek mięśni gładkich aorty

Poczytaj o

• Przechowywanie
• Preparation for Culturing
• Culturing HAOSMC
• Subculturing HAOSMC
• Differentiating HAOSMC
• Materiały

I. Przechowywanie

Przechowuj kriofiole (354-05a, 354-05f) w zbiorniku z ciekłym azotem* natychmiast po dostarczeniu.

* Podczas pobierania fiolek z ciekłego azotu należy nosić maskę ochronną i rękawice. Gwałtowna zmiana temperatury między zbiornikiem a pomieszczeniem może spowodować rozerwanie uwięzionego w fiolkach ciekłego azotu i obrażenia.

Ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HAOSMC)

II. Przygotowanie do hodowli

1. Upewnij się, że szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II z laminarnym przepływem powietrza z filtrem HEPA jest w odpowiednim stanie technicznym.
2. Sterylizuj szafę bezpieczeństwa biologicznego 70% alkoholem.
3. Włącz dmuchawę szafy bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut przed rozpoczęciem pracy z hodowlą komórkową.
4. Upewnij się, że wszystkie pipety serologiczne, końcówki pipet i roztwory odczynników są sterylne.
5. Przestrzegaj standardowej techniki sterylizacji i zasad bezpieczeństwa:

• Nie pipetuj doustnie.
• Zawsze noś rękawice i okulary ochronne podczas pracy z ludzkimi komórkami, nawet jeśli wszystkie szczepy mają negatywny wynik testu na obecność wirusa HIV, zapalenia wątroby typu B i zapalenia wątroby typu C.
• Wszystkie prace związane z hodowlą komórek należy wykonywać w sterylnym pomieszczeniu.

III. Hodowla HAOSMC

Przygotowanie kolb do hodowli komórkowej HAOSMC

1. Wyjmij z lodówki pożywkę do wzrostu komórek mięśni gładkich (311-500). Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym pomieszczeniu.
2. Odmierzyć pipetą 15 ml* pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich (311-500) do kolby T-75 (SIAL0641).

*Zachowaj stosunek pożywki do powierzchni na poziomie 1 ml na 5 cm². Na przykład:

• 5 mL dla kolby T-25 (SIAL0639) lub szalki do hodowli tkanek o średnicy 60 mm (SIAL0166).
• 15 ml dla kolby T-75 (SIAL0641) lub szalki do hodowli tkanek o średnicy 100 mm (SIAL0167).

B. Rozmrażanie i umieszczanie HAOSMC

1. Wyjmij kriokonserwowaną fiolkę HAOSMC ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu, stosując odpowiednią ochronę oczu i rąk.
2. Obróć korek fiolki o ćwierć obrotu, aby uwolnić ciekły azot, który może być uwięziony w gwintach, a następnie ponownie dokręć korek.
3. Szybko rozmroź komórki, umieszczając dolną połowę fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C i uważnie obserwuj fiolkę podczas procesu rozmrażania.
4. Wyjmij fiolkę z łaźni wodnej, gdy w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Nie pozwól na całkowite rozmrożenie komórek.
5. Odkaż zewnętrzną część fiolki 70% alkoholem w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
6. Usuń ostrożnie korek fiolki. Nie dotykaj brzegu nakrętki ani fiolki rękami, aby uniknąć zanieczyszczenia.
7. Zawieś ponownie komórki w fiolce, delikatnie pipetując komórki 5 razy pipetą o pojemności 2 ml. Uważaj, aby nie pipetować zbyt energicznie, aby nie spowodować pienienia.
8. Zmieszaj pipetą zawiesinę komórek (1 ml) z fiolki do kolby T-75 (SIAL0641) zawierającej 15 ml pożywki do wzrostu komórek mięśni gładkich (311-500).
9. Zamknąć kolbę i delikatnie wstrząsnąć, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
10. Umieścić kolbę T-75 (SIAL0641) w inkubatorze z nawilżaniem 37^oC, 5% CO₂ . Poluzuj pokrywę, aby umożliwić wymianę gazową. Aby uzyskać najlepsze wyniki, nie należy zakłócać hodowli przez 24 godziny po inokulacji.
11. Zmień na świeże Smooth Muscle Cell Growth Medium (311-500) po 24 godzinach lub przez noc, aby usunąć wszystkie ślady DMSO.
12. Zmień Smooth Muscle Cell Growth Medium (311-500) co drugi dzień, aż komórki osiągną 60% konfluencji.
13. Podwoić objętość pożywki do wzrostu komórek mięśni gładkich (311-500), gdy hodowla osiągnie 60% konfluencji lub w przypadku karmienia weekendowego.
14. Podkulturuj komórki, gdy hodowla HAOSMC osiągnie 80% konfluencji.

IV. Podhodowla HAOSMC

Przygotowanie odczynników do podhodowli

1. Wyjmij Roztwór trypsyny-EDTA  (T3924) i Inhibitor trypsyny  (T6414) z zamrażarki o temperaturze -20°C i rozmroź przez noc w lodówce.
2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki do podhodowli są rozmrożone. Delikatnie zawiruj każdą butelkę kilka razy, aby utworzyć jednorodne roztwory.
3. Przechowuj wszystkie odczynniki do podhodowli w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
4. Aliquot Trypsin/EDTA solution (T3924) i przechowuj niewykorzystaną część w temperaturze -20 °C, jeśli potrzebna jest tylko część Trypsin/EDTA (T3924).

Przygotowanie kolby hodowlanej

1. Wyjmij Pożywkę do wzrostu komórek mięśni gładkich (311-500) z lodówki. Odkazić butelkę 70% alkoholem w sterylnym pomieszczeniu.
2. Odmierzyć pipetą 30 ml pożywki do hodowli komórek mięśni gładkich (311-500) do kolby T-175 (SIAL1080) (do użycia w sekcji IV C, krok 15).)

Podhodowla HAOSMC

Trypsynuj komórki w temperaturze pokojowej. Nie podgrzewać żadnych odczynników do temperatury 37°C.

1. Usuń pożywkę z kolb hodowlanych przez aspirację.
2. Przepłucz monowarstwę komórek za pomocą HBSS (H6648) i usuń roztwór przez aspirację.
3. Pobierz pipetą 8 ml roztworu trypsyny/EDTA (T3924) do kolby T-75 (SIAL0641). Delikatnie potrząśnij kolbą, aby upewnić się, że roztwór pokrywa wszystkie komórki.
4. Natychmiast usuń 7 ml roztworu.
5. Zamknij szczelnie kolbę i monitoruj postęp trypsynizacji w temperaturze pokojowej pod odwróconym mikroskopem. Zazwyczaj potrzeba około 2 do 4 minut, aby komórki stały się zaokrąglone.
6. Uwolnij zaokrąglone komórki z powierzchni hodowli, uderzając bokiem kolby o dłoń, aż większość komórek zostanie odłączona.
7. Nanieś pipetą 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) do kolby, aby zahamować dalszą aktywność tryptyczną.
8. Przenieść zawiesinę komórek z kolby do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
9. Przepłucz kolbę dodatkowymi 5 ml roztworu inhibitora trypsyny (T6414) i przenieś roztwór do tej samej probówki stożkowej.
10. Zbadaj kolbę T-75 (SIAL0641) pod mikroskopem. Jeśli w kolbie pozostało 20% komórek, powtórz kroki 2-9.
11. Wiruj probówkę stożkową z prędkością 220 x g przez 5 minut, aby osuszyć komórki.
12. Spuść supernatant z probówki bez naruszania osadu komórek.
13. Przesuń końcówkę stożkowej probówki palcem, aby poluzować osad komórek.
14. Zawieś ponownie komórki w 5 ml pożywki do wzrostu komórek mięśni gładkich  (311-500), delikatnie pipetując komórki w celu rozbicia grudek.
15. Zlicz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zaszczepić 10 000 komórek na cm² w przypadku szybkiego wzrostu lub 6 000 komórek na cm² w przypadku regularnej subkultury.

V. Różnicowanie HAOSMC

Siew HAOSMC do różnicowania

1. Siej HAOSMC w pożądanym formacie w ilości 15 000 na cm² w pożywce do wzrostu komórek mięśni gładkich (311-500).
2. Umieść komórki w 37 ^oC, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze.
3. Następnego dnia zmień pożywkę na pożywkę do różnicowania komórek mięśni gładkich  (311D-250), usuwając pożywkę wzrostową z tkanki hodowlanej przez aspirację i dodając odpowiednią objętość pożywki do różnicowania komórek mięśni gładkich  (311D-250). Nie dopuść do wyschnięcia komórek podczas zmiany pożywki.
4. Inkubuj komórki w 37 ^oC, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze.

Różnicowanie HAOSMC w celu ekspresji białek kurczliwych

1. Usuń pożywkę do różnicowania komórek mięśni gładkich (311D-250) z tkanki hodowlanej przez aspirację. Nie dopuścić do wyschnięcia komórek podczas zmiany pożywki.
2. Dodać odpowiednią objętość pożywki do różnicowania komórek mięśni gładkich (311D-250).
3. Inkubuj komórki w 37°C, 5% CO₂ nawilżanym inkubatorze w pożywce do różnicowania komórek mięśni gładkich (311D-250).
4. Zmieniaj na świeżą pożywkę do różnicowania komórek mięśni gładkich   (311D-250) co drugi dzień.
5. HAOSMC są w fazie zatrzymania wzrostu, a a-aktyna mięśni gładkich ulega ekspresji w ciągu 10 dni.