Wskazówki i porady dotyczące HPLC: Optymalizacja objętości wtrysku
Dr. Egidijus Machtejevas, Sr. Technical Advisor, Analytical Chromatography Workflows
Merck
Obszar piku ma liniową zależność od objętości iniekcji/stężenia próbki, jeśli kolumna i/lub detektor nie są jeszcze przeciążone i jeśli próbka jest rozpuszczona w fazie ruchomej, która przepływa przez kolumnę w momencie iniekcji (efekty związane z różnymi rozcieńczalnikami próbek zostaną omówione w jednym z kolejnych poradników HPLC). Zwykle z obciążeniem próbki kojarzymy przede wszystkim objętość wtrysku, która w HPLC jest zwykle określana przez ustawienie autosamplera. W przypadku rozcieńczonych próbek, zwiększenie objętości próbki można uznać za jedną z opcji poprawy granicy wykrywalności/czułości. Istnieją jednak pewne efekty związane ze zwiększoną objętością wtrysku i/lub stężeniem w HPLC/UHPLC, które mają miejsce: kolumna może zostać przeciążona, jeśli na kolumnę zostanie wstrzyknięta zbyt duża ilość próbki; wysokość piku wzrośnie wraz z większą objętością wtrysku; szerokość piku poszerzy się wraz ze wzrostem objętości wtrysku. Suma wcześniej wspomnianych efektów oznaczałaby, że zwiększenie objętości wtrysku może spowodować zmniejszenie rozdzielczości między rozdzielanymi związkami (w przypadku przeciążenia). Ważne jest, aby pamiętać, że zmiana objętości wtrysku, ogólnie rzecz biorąc, wpłynie na pik (wysokość, objętość i szerokość) zależny od: wymiarów kolumny (długość i średnica), wielkości i rodzaju cząstek upakowania (w pełni porowaty, powierzchniowo porowaty lub monolityczny materiał, a także jego powierzchnia, gęstość funkcjonalizacji, tryb chromatograficzny i mechanizm retencji) oraz retencji piku (wartość pojemności piku). Zasadą jest, że w przypadku każdej zmiany systemu chromatograficznego (krótsza kolumna, węższa kolumna, mniejszy rozmiar cząstek lub krótsza retencja), która zmniejsza końcową objętość piku eluującego z kolumny, objętość próbki powinna być proporcjonalnie zmniejszona, aby uniknąć utraty rozdzielczości.
Ocena sumy wszystkich tych różnych parametrów jest dość trudna, dlatego najczęściej zwracamy się do bardziej pragmatycznego podejścia i patrzymy tylko na rozmiar kolumny i minimalną rozdzielczość, która jest nadal akceptowalna. Istnieje ogólnie przyjęta zasada, która zaleca, aby objętość wtrysku nie była większa niż 1%-2% całkowitej objętości kolumny (biorąc pod uwagę stężenie próbki ~ 1 µg/µL, co jest standardową wartością w analitycznej chromatografii cieczowej); jednak każdy może / powinien określić rzeczywiste maksymalne dopuszczalne obciążenie, wykonując po prostu kilka różnych zastrzyków obciążenia i porównując krytyczną rozdzielczość pary pików lub parametry wydajności chromatograficznej głównego piku. Jako przykład, dla powszechnie stosowanej kolumny UHPLC o wymiarach 50 x 2,1 mm, która ma 173 µL całkowitej objętości i objętość pustej przestrzeni ~120 µL (biorąc pod uwagę współczynnik 0,7 dla opakowania z całkowicie porowatymi cząstkami), wstrzykiwana objętość powinna mieścić się w zakresie 1,2 i 2,4 µL (gdy stężenie próbki wynosi ~1 µg/µL), aby ograniczyć poszerzenie pasma i utratę rozdzielczości (kilka innych przykładów: 4,6 mm I.D. i 50 do 250 mm długości - idealna objętość wtrysku między 5,8 a 58 µL, 3 mm I.D. 50 do 150 mm długości idealna objętość wtrysku między 2,5 a 14,8 µL. Należy zauważyć, że przebiegi izokratyczne są znacznie bardziej podatne na efekty przeciążenia objętościowego niż metody gradientowe. W przypadku przebiegów izokratycznych możemy w przybliżeniu obliczyć zalecany limit objętości wstrzyknięcia, dzieląc objętość retencji piku (w µL, natężenie przepływu pomnożone przez czas elucji piku) przez pierwiastek kwadratowy z wydajności piku (płytki na kolumnę).
Jak można zauważyć, że kolumna jest (objętościowo) przeciążona? Gdy bardzo duża objętość próbki jest wstrzykiwana do kolumny HPLC, piki zaczynają się bardziej przodować (współczynnik symetrii piku < 1), a czas retencji może się skrócić, co powoduje spadek wydajności kolumny i rozdzielczości separacji. Sztuczka polega na znalezieniu najlepszego punktu, równowagi między rozdzielczością a czułością (temat czułości omówiłem już w numerze 9 tego czasopisma). W praktyce jest to łatwe do zrobienia. Zacznij od najmniejszej objętości, którą wtryskiwacz może wstrzyknąć w sposób powtarzalny i podwajaj ją, aż do osiągnięcia maksymalnie 3% objętości kolumny. Następnie oblicz granicę wykrywalności i zależność rozdzielczości od objętości wtrysku. Przygotuj się na konieczność zaakceptowania kompromisu między granicą wykrywalności a rozdzielczością.
Inne wskazówki i sztuczki HPLC (zobacz także powiązane artykuły)
.Aby uzyskać więcej informacji na temat opracowywania metod HPLC, pobierz nasz przewodnik A Practical Guide to HPLC - Method Development Guide lub obejrzyj nasze webinarium HPLC Method Development in 1. 5 Days using Selectivity Concept.5 dni z wykorzystaniem koncepcji selektywności
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?