Jak zmaksymalizować czułość w LC-MS
Stephan Altmaier
Wprowadzenie
Warunkiem wstępnym każdej wysoce czułej analizy za pomocą HPLC-MS (wysokosprawna chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas) jest stosowanie ultraczystych rozpuszczalników i odczynników oraz ostrożne obchodzenie się ze wszystkimi powiązanymi materiałami, materiałami eksploatacyjnymi i systemami. Zapobiega to wszelkim zanieczyszczeniom w całym procesie obsługi próbki, od przygotowania do wykrywania MS, i poprawia czułość.
W poniższych sekcjach przedstawiono różne środki i opcje maksymalizacji czułości LC-MS i niskiej granicy wykrywalności (LOD). Każda wskazówka pozwala uniknąć zanieczyszczeń powodujących tłumienie sygnału, tworzenie adduktów, podwyższony szum tła i zwiększoną złożoność widma.
Rozpuszczalniki i dodatki - informacje ogólne
Typowe rozpuszczalniki stosowane w LC-MS obejmują wodę, acetonitryl, metanol, izopropanol i n-propanol. Dodatki takie jak kwasy (np. kwas mrówkowy), zasady (np. amoniak) lub bufory (np. octan amonu) są stosowane w celu umożliwienia protonowania lub deprotonowania analitów.
Jakość wyżej wymienionych rozpuszczalników i dodatków silnie wpływa na czułość wykrywania MS; dlatego stosowanie rozpuszczalników klasy MS i ultraczystych dodatków jest obowiązkowe. Należy upewnić się, że odczynniki te są oznaczone przez producenta jako klasy LC-MS.
Ogólnie rzecz biorąc, rozpuszczalniki organiczne do HPLC, takie jak acetonitryl i metanol, są dostępne w trzech klasach jakości: Isocratic grade, gradient grade i hypergrade dla LC-MS LiChrosolv®. Do analizy MS należy stosować rozpuszczalniki o jakości hypergrade, aby zapewnić najlepszą wydajność i wiarygodne wyniki.
W odniesieniu do wody, woda butelkowana lub Milli-Q® ultraczysta woda z systemów oczyszczania wody jest odpowiednia do stosowania z oprzyrządowaniem MS. W przypadku niskiego zużycia wody preferowana jest woda butelkowana, podczas gdy woda Milli-Q® jest zalecana w środowisku o wyższym zużyciu. Systemy Milli-Q® dostarczają wodę typu I i doskonale nadają się do analizy LC-MS. Powinny być regularnie używane/płukane w celu utrzymania lub nawet dalszej poprawy jakości wody.
Bufory są wykorzystywane do ustawiania i kontrolowania pH określonego rozdziału chromatograficznego oraz do protonowania lub deprotonowania analitów w roztworze, co może wspomagać proces jonizacji elektrorozpylania. W przypadku LC-MS należy stosować wyłącznie lotne bufory i dodatki, takie jak mrówczan lub octan amonu lub trietyloamina. Stosowanie nielotnych buforów (np. siarczanów, fosforanów, boranów) spowoduje wytrącanie się osadów w źródle MS i ostatecznie doprowadzi do żmudnych procedur czyszczenia. Wysokie stężenia buforów mogą prowadzić do tłumienia sygnału.
Bufory jonizują cząsteczkę analitu M, ale możliwe jest tworzenie adduktów [M+bufor] np. z amonem, mrówczanem lub octanem. Powoduje to dodatkowe sygnały o określonych wartościach m/z w widmie, co może zagrozić analizom ilościowym. W związku z tym, w przypadku próbek o wysokim ładunku soli, takich jak żywność, płyny ustrojowe lub tkanki, etap odsalania przy użyciu ekstrakcji do fazy stałej (SPE) (np, Supel™-Select HLB lub LiChrolut® i Supelclean® wkłady).
Bufory powinny być przygotowywane przez miareczkowanie odpowiednich kwasów i zasad, ponieważ ich czystość jest zwykle wyższa niż odpowiednich soli. Jeśli konieczne jest użycie soli, przed użyciem należy przeprowadzić analizę MS użytych soli w celu ustalenia, czy i jaki rodzaj zanieczyszczeń jest obecny w solach.
Zanieczyszczenia lub zanieczyszczenia rozpuszczalników i dodatków mogą gromadzić się na fazie stacjonarnej i eluować jako piki duchów w przebiegach gradientowych (Rysunek 1). Scenariusz ten może wystąpić, gdy kolumna jest równoważona w warunkach silnie wodnych przed przebiegiem gradientowym. Piki widma mogą pojawić się nawet bez wyrównania, jeśli stężenie i / lub retencyjność zanieczyszczeń jest wysoka i / lub warunki początkowe gradientu są wysoce wodne. Aby uniknąć pików widmowych w przebiegach gradientowych, czas wyrównania kolumny powinien być jak najkrótszy, a objętość płukania nie powinna przekraczać dziesięciu objętości kolumny.
Rysunek 1.Akumulacja zanieczyszczeń na kolumnie HPLC
Należy unikać silnych kwasów, takich jak kwas solny, kwas siarkowy lub kwas azotowy, ponieważ mają one tendencję do tworzenia silnych par jonowych z analitami, a zatem sprawiają, że analit nie nadaje się do żadnego rodzaju jonizacji. Dodatkowo, niektóre z tych silnych kwasów mają niekorzystne właściwości utleniające.
W wielu laboratoriach stosuje się kwas trifluorooctowy (TFA) w celu utworzenia par jonów z peptydami i białkami oraz poprawy późniejszej separacji HPLC; jednak TFA powoduje silne tłumienie jonów analitu podczas wykrywania MS i może również zanieczyścić spektrometr mas. Jeśli użycie TFA jest konieczne, należy dodać słaby kwas lub izopropanol, aby zmniejszyć efekt tłumienia sygnału. Alternatywnie, kwas difluorooctowy (DFA) jest opcją, która zmniejsza efekt tłumienia sygnału (w porównaniu do stosowania TFA).
Rozpuszczalniki & Dodatki - Przechowywanie & Obsługa
Rozpuszczalniki powinny być przechowywane w oryginalnej butelce producenta; może to być szkło bursztynowe lub borokrzemianowe poddane obróbce powierzchniowej. Zaleca się dostosowanie rozmiaru butelki do konkretnych potrzeb, ponieważ w miarę możliwości należy unikać dekantacji / przenoszenia do innego pojemnika, źródła zanieczyszczenia.
Unikaj standardowych butelek ze szkła przezroczystego lub sodowo-wapniowego. Wypłukiwane alkalia i krzemionka mogą tworzyć addukty z analitami.
Butelki muszą być szczelnie zamknięte i podłączone do systemu HPLC za pomocą profesjonalnych nakrętek, adapterów i rurek zamontowanych bezpośrednio na butelce z rozpuszczalnikiem. Wszelkie domowe rozwiązania prawdopodobnie spowodują zanieczyszczenie rozpuszczalnika lub eluentu i mogą prowadzić do odparowania rozpuszczalników organicznych do atmosfery laboratoryjnej.
Unikaj plastikowych urządzeń, takich jak butelki, lejki, zlewki lub rękawice, które mogą wymywać dodatki, takie jak plastyfikatory, środki antystatyczne, stabilizatory lub środki antypoślizgowe (Rysunek 2). Jedynymi wyjątkami są urządzenia, które zostały przetestowane przez producenta pod kątem wymywalności i ekstrahowalności, np. końcówki do pipet lub strzykawki.
Rysunek 2.Widma masowe dwóch próbek wody Milli-Q® przechowywanych odpowiednio w butelkach z polipropylenu (A) i czystego bursztynowego szkła (B) (u dołu) oraz TIC tych samych próbek (u góry). Analizy przeprowadzono poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie rozpuszczalników do MS pracującego w trybie dodatnim ESI.
Sprzęt laboratoryjny
Czyszczenie sprzętu laboratoryjnego i naczyń można najprościej wykonać przez odparowanie w wyciągu, ponieważ wszystkie odczynniki używane w zastosowaniach MS są lotne i mają wysoką czystość. W przypadkach, w których zaobserwowano zanieczyszczenie, konieczne będzie przepłukanie rozpuszczalnikami klasy MS w celu prawidłowego oczyszczenia sprzętu.
Jeśli z jakiegokolwiek powodu konieczne jest użycie zmywarki, bardzo ważne jest, aby po umyciu naczynia zostały wielokrotnie przepłukane rozpuszczalnikiem klasy MS.
Kolumna HPLC
Wybór rozmiaru kolumny HPLC jest podyktowany nie tylko czynnikami takimi jak wielkość próbki, technika wykrywania i niezbędna obciążalność, ale także względami ekonomicznymi, takimi jak zmniejszenie zużycia rozpuszczalnika. Zmniejszenie średnicy wewnętrznej kolumny (i.d.), przy jednoczesnym geometrycznym skalowaniu objętości wtrysku i natężenia przepływu, jest prostym sposobem na poprawę czułości danego rozdziału.
Możliwym i częstym, ale często pomijanym źródłem zanieczyszczeń w przebiegu LC-MS jest sama kolumna chromatograficzna. Wiele faz związanych na bazie krzemionki jest z natury podatnych na rozszczepienie wiązania/fazy przez hydrolizę, głównie przy kwaśnym pH (np. poniżej pH 2), zjawisko określane jako krwawienie z kolumny (Rysunek 3).
Zastosowanie protokołu płukania może pomóc zmniejszyć negatywny wpływ krwawienia z kolumny. Alternatywnie, kolumna powinna zostać poddana do dziesięciu przebiegom gradientu od silnie wodnego do silnie organicznego przed użyciem z MS.
System HPLC
Właściwa konfiguracja samego systemu HPLC może również przyczynić się do zwiększenia czułości. Ważnym parametrem jest minimalizacja objętości martwej, tj. objętości wszystkich części systemu od wtryskiwacza do detektora, z wyjątkiem objętości kolumny HPLC. Duże objętości martwe mogą powodować poszerzenie piku, ogonowanie lub rozszczepienie i prowadzić do słabej rozdzielczości i obniżonej wydajności, a tym samym mogą zmniejszać czułość i uniemożliwiać wykrywanie analitów o niskiej zawartości. W związku z tym wszystkie części systemu (rurki, złącza, łączniki) muszą mieć jak najmniejszą objętość martwą.
Wymieniaj filtr wlotowy pompy co 1 do 2 miesięcy lub po zmianie acetonitrylu na metanol (lub odwrotnie) jako rozpuszczalnik. Taka konserwacja obniży hałas linii bazowej i ochroni system i kolumnę przed zanieczyszczeniami pompy.
Fryty filtracyjne eluentu (z filtrów wlotowych rozpuszczalnika) powinny być wykonane ze stali nierdzewnej lub PEEK, a nie ze szkła.
Czyszczenie tego ostatniego jest żmudne, ponieważ pozostałości buforu są trudne do usunięcia, a krzemionka i zasady mogą być wymywane ze szklanego filtra i tworzyć addukty.
W przypadku filtrów wlotowych rozpuszczalnika, filtry wlotowe powinny być wykonane ze stali nierdzewnej lub PEEK, a nie ze szkła.
Rysunek 3.Kwantyfikacja krwawienia z kolumn HILIC dla różnych kolumn
Ogólne zalecenia
Specyficzne wymagania różnych problemów chromatograficznych mogą powodować konieczność stosowania różnych składów fazy ruchomej, od wodnej do organicznej. Zgodnie z ogólnymi zaleceniami, zawartość wody w eluencie stosowanym w LC-MS powinna wynosić od 5 do 80%, aby zapewnić bezproblemową pracę i stabilne rozpylanie.
Jeśli zawartość wody jest niższa niż 5%, bufory mogą wytrącać się w eluencie i systemie HPLC. Środkiem zaradczym może być zastosowanie odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego lub zmniejszenie stężenia buforu w eluencie. Rozpuszczalność buforu w stosowanych rozpuszczalnikach (i zakres gradientu) należy zawsze sprawdzić przed analizą.
Zawartość wody powyżej 80% może prowadzić do awarii sprayu MS.
- Zmniejszenie napięcia powierzchniowego eluentu poprzez dodanie lotnego rozpuszczalnika organicznego, takiego jak acetonitryl lub metanol do fazy ruchomej za systemem LC i przed źródłem MS.
- Zmniejszenie przepływu dostarczanego do MS za pomocą podziału lub wymiany kolumny.
- Manipulacja warunkami źródła MS (zwiększenie temperatury lub przepływu suchego gazu).
W celu uniknięcia zanieczyszczenia mikrobiologicznego zarówno systemu, jak i fazy ruchomej oraz zapadnięcia się fazy, zawartość wody w fazie ruchomej nie powinna przekraczać 95%. Jeśli konieczna jest wysoce wodna faza ruchoma, do eluentu można dodać 0,05% azydku sodu.
Alternatywnie, regularne płukanie systemu HPLC rozpuszczalnikiem organicznym, najlepiej izopropanolem lub metanolem, przed gotowością jest obowiązkowe. Nie należy używać acetonitrylu, ponieważ acetonitryl może polimeryzować i blokować zawory systemu.
Wnioski
Spektrometria mas jest potężną techniką identyfikacji i kwantyfikacji cząsteczek w złożonych mieszaninach. Sukces spektrometrii mas w dużym stopniu zależy od zmniejszenia zanieczyszczenia w całym procesie LC-MS: od przygotowania próbki do czyszczenia sprzętu. Ważnym pierwszym krokiem w tym procesie jest wyłączne stosowanie najwyższej jakości materiałów do LC-MS, w tym rozpuszczalników, buforów, odczynników i kolumn. Połączenie ultraczystych rozpuszczalników i odczynników z obsługą wolną od zanieczyszczeń zapewnia maksymalną czułość LC-MS i niskie wartości LOD.
Pierwsza publikacja w Chromatography Today, tom 10, wydanie 4, Buyers Guide listopad/grudzień 2017.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?