Oczyszczanie białek znakowanych białkiem A

Rekombinowane znakowane białka zawierające znacznik białka A mogą być oczyszczane na IgG Sepharose^® 6 Fast Flow. Podłoże AC jest oparte na matrycy Sepharose^® 6 Fast Flow, z kowalencyjnie sprzężoną ludzką IgG. Charakterystyka mechaniczna tego podłoża Fast Flow pozwala na stosowanie dużych prędkości przepływu (do 400 cm/h) do szybkiego i wygodnego jednoetapowego oczyszczania koniugatów białkowych znakowanych białkiem A, wytwarzanych w prokariotycznych systemach ekspresyjnych. Do 2 mg/ml białka A może być związane z ligandem przy pH 7,5.

IgG Sepharose^® 6 Fast Flow nadaje się również do oczyszczania tandemowego (TAP) kompleksów białkowych.

Alternatywnym eluentem jest 0,1 M glicyna-HCl, pH 3,0. Do elucji można również stosować środki chaotropowe.

Charakterystykę IgG Sepharose^® 4 Fast Flow przedstawiono w Tabeli 1.

.

Tabela 1. Charakterystyka sefarozy IgG^® 6 Fast Flow

Ligand	Skład	Stabilność pH*	Rozmiar cząsteczek
Ludzka poliklonalna IgG	IgG sprzężona z Sepharose® Fast Flow metodą bromku cyjanu.	Krótkoterminowy 3-10 Długoterminowy 3-10	90 µm

* Krótkoterminowy odnosi się do przedziału pH dla procedur regeneracji, czyszczenia na miejscu i odkażania. Długoterminowy odnosi się do przedziału pH, w którym pożywka jest stabilna przez długi okres czasu bez negatywnego wpływu na jej późniejszą wydajność chromatograficzną.

Wykonywanie separacji przy użyciu IgG Sepharose^® 6 Fast Flow

Przygotowanie buforu

Bufor wiążący: Bufor płuczący: Bufor elucyjny: Bufor neutralizujący:

0,05 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7,6 5 mM octan amonu, pH 5,0 0,5 M kwas octowy, dostosowany do pH 3,4 octanem amonu 1 M Tris-HCl, pH 9,0

Purifikacja

1. Zapakuj kolumnę (Characteristics of Dextrin Sepharose High Performance products) i przemyć co najmniej 5 objętościami buforu wiążącego.
2. Wyrównać kolumnę za pomocą około 5 objętości buforu wiążącego.
3. Płukać 2-3 objętościami kwasu octowego, a następnie 5 objętościami buforu wiążącego.
4. Nałożyć próbkę.
5. Płukać 10 objętościami buforu wiążącego.
6. Płukać 2 objętościami buforu płuczącego lub do momentu, gdy w eluencie nie pojawi się żaden materiał (określony przez absorbancję UV przy A280 nm).
7. Elutować 2-5 objętościami buforu elucyjnego.*
8. Natychmiast ponownie wyrównać kolumnę buforem wiążącym, aż eluent osiągnie pH 7,0 (IgG może ulec denaturacji, jeśli pozostanie w niższym pH).

* Ponieważ warunki elucji są dość trudne, zaleca się zebranie frakcji do buforu neutralizującego (60 µL - 200 µL 1 M Tris-HCl, pH 9.0 na ml frakcji), tak aby końcowe pH frakcji było w przybliżeniu neutralne.
Ta metoda, choć daje stężony eluat, może być stosowana tylko wtedy, gdy produkt fuzji jest stabilny w warunkach kwasowych.

Przykład zastosowania

Tabela 2. przedstawia automatyczne monitorowanie on-line produkcji wydzielanego białka fuzyjnego podczas fermentacji. Białko fuzyjne ZZ-IGF-1 to insulinopodobny czynnik wzrostu 1 połączony z pochodną białka A (oznaczoną jako ZZ), wyrażoną w E. coli.

Kolumna:	IgG Sepharose® 6 Fast Flow (0,5 × 2.5 cm)
Próbka:	Zawiesina bakteryjna zawierająca białko fuzyjne ZZ-IGF-1, automatycznie pobrana próbka z bulionu fermentacyjnego, 500 µl
Bufor wiążący:	0.05 M Tris-HCl, 0,05% Tween 20, pH 7.6
Bufor płuczący:	10 mM octan amonu, pH 4.6
Bufor elucyjny:	0,2 M kwas octowy, pH 3,2

Rysunek 1. Chromatogram próbki pobranej w jednym punkcie czasowym podczas fermentacji. (B) Wyniki automatycznego monitorowania stężenia produktu podczas fermentacji. Stężenie ZZ-IGF-1 jest określane przez integrację piku ZZ-IGF-1 uzyskanego podczas każdej analizy chromatograficznej. Gęstość bakterii jest mierzona ręcznie przy A600 nm.

Stabilność chemiczna

Unikać środków redukujących, takich jak 2-merkaptoetanol lub DTT, ponieważ mogą one zakłócać wiązania disiarczkowe w ligandzie IgG.

Przechowywanie

Płukać 5 objętościami kolumny 20% etanolu o neutralnym pH i przechowywać w temperaturze od +4 °C do +8 °C.