Przeprowadzanie izolacji natywnych kompleksów

Naturalne kompleksy wielobiałkowe (nierekombinowane, bez znaczników przynależności) mogą być oczyszczane do badań strukturalnych i funkcjonalnych przy użyciu klasycznych metod biochemicznych. Naturalne źródło kompleksu docelowego jest wykorzystywane jako materiał wyjściowy do oczyszczania, a do izolacji kompleksu stosuje się kombinację chromatografii i innych technik. Podejście to jest w zasadzie identyczne z tym, które było z powodzeniem stosowane do izolacji pojedynczych białek od lat 60-tych XX wieku.

Niektóre punkty, które należy wziąć pod uwagę przy tym podejściu, są wymienione w Tabeli 1.

.

Tabela 1. Punkty, które należy wziąć pod uwagę przy izolacji natywnych kompleksów przy użyciu klasycznego podejścia biochemicznego.

Zalety	Wady
Użycie odpowiedniego źródła biologicznego ogranicza ryzyko artefaktów	Duże ilości materiału wyjściowego są wymagane do izolacji naturalnie mało obfitych kompleksów
Bez manipulacji (np.g., tagowanie afityczne) podjednostek ogranicza ryzyko artefaktów	Nowa procedura oczyszczania musi być empirycznie opracowana dla każdego kompleksu. Schematy oczyszczania mają tendencję do posiadania wielu etapów chromatograficznych i są bardziej żmudne niż w przypadku znakowanych białek
Nie wymaga ponownego składania kompleksu - ogranicza ryzyko artefaktów

Schemat oczyszczania najlepiej zaprojektować, łącząc ortogonalne techniki w sekwencji, na przykład łącząc chromatografię afrykcyjną (rozdzielanie zgodnie z biopecyficznością) z wymianą jonową (rozdzielanie zgodnie z właściwościami ładunku) i filtracją żelową (rozdzielanie zgodnie z rozmiarem). Różne techniki powinny być łączone w sposób, który minimalizuje wymagania dotyczące obróbki próbki między etapami oczyszczania (patrz Zasady i standardowe warunki dla różnych technik oczyszczania). Przydatne techniki chromatograficzne przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2. Techniki chromatograficzne i rozważania dotyczące oczyszczania kompleksów wielobiałkowych.

Technika	Zasada separacji	Zalety (+) i wady (-) oczyszczania kompleksów wielobiałkowych<
Filtracja żelowa	Rozmiar i kształt	+ Łagodne warunki separacji; separację można osiągnąć w szerokim zakresie pH i siły jonowej + Możliwość stosowania dodatków
Chromatografia afityczna	Biologiczna afityczność	+ Doskonała specyficzność - Ligandy afityczne (dla chromatografii)nie można znaleźć odpowiednich ligandów (dla kulek chromatograficznych) dla wszystkich białek - Elucja może wymagać warunków (pH, siła jonowa), które mogą zakłócać interakcje wewnątrzkompleksowe
Chromatografia jonowymienna	Ładunek	+ Często można osiągnąć wysoką rozdzielczość
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych	Hydrofobowość	+ Przydatne uzupełnienie innych technik - Wysokie stężenia soli (np.g., 1-2 M siarczan amonu) są często stosowane podczas nanoszenia próbki. Może to zakłócać interakcje wewnątrzkompleksowe

Ważne jest, aby ograniczyć liczbę etapów do minimum, aby zmaksymalizować wydajność oczyszczania. Jednak w przypadku trudnych procesów oczyszczania, takich jak te dla kompleksów wielobiałkowych, może być konieczne zastosowanie większej liczby etapów oczyszczania w celu osiągnięcia pożądanej czystości. Na przykład, ludzki proteasom (20S) (zawierający 14 podjednostek, Mr ~ 700 000) i kompleksy prekursorowe zostały wyizolowane z ludzkiej linii komórkowej przy użyciu kombinacji chromatografii anionowymiennej, wirowania w gradiencie sacharozy, chromatografii afrytycznej, chromatografii oddziaływań hydrofobowych i filtracji żelowej.

Podczas oczyszczania kompleksów należy unikać trudnych warunków separacji obejmujących skrajne wartości pH lub siły jonowej, aby zminimalizować ryzyko dysocjacji podjednostek podczas procesu oczyszczania.

Filtracja żelowa rozdziela według wielkości i jest idealną techniką do izolacji kompleksów wielobiałkowych, ponieważ jest łagodna, a także dlatego, że wiele kompleksów jest znacznie większych niż główne zanieczyszczenia. Przydatne media do filtracji żelowej dla kompleksów białkowych i dużych cząsteczek są wymienione w Tabeli 3.

Tabela 3. Media do filtracji żelowej o wysokiej porowatości, a zatem szczególnie odpowiednie do oczyszczania kompleksów wielobiałkowych.

Produkt	Użyteczny zakres separacji*	Komentarz
	Komentarz
Superdex 200	10 000 - 600 000	Dostępne jako wstępnie zapakowane kolumny
Superose™ 6	5 000-5 000 000	Dostępne jako wstępnie zapakowane kolumny
Sephacryl™ S-300 HR	10 000 - 1 500 000	Dostępne jako kolumny konfekcjonowane
Sephacryl S-400 HR	20 000 - 8 000 000
Sephacryl S-500 HR	Brak danych (wyższa porowatość niż Sephacryl S-400 HR)	Granica wykluczenia ~200 nm
Sephacryl S-1000 SF	Brak danych (wyższa porowatość niż Sephacryl S-500 HR)	Granica wykluczenia ~400 nm

*Mr dla białek globularnych