Inhibicja proteazy przy użyciu mieszaniny inhibitorów proteazy
Protease Inhibitor Mix firmy Cytiva zawiera zoptymalizowane stężenie kompetycyjnych i niekompetycyjnych inhibitorów proteaz, które skutecznie hamują proteazy serynowe, cysteinowe, metaloproteazy i kalpainy. Zestaw jest odpowiedni do ochrony białek podczas oczyszczania z tkanek zwierzęcych, roślinnych, drożdży i bakterii.
Protokół: Protease Inhibitor Mix
Dostarczone odczynniki
Protease Inhibitor Mix (100× roztwór), 1 ml.
Wymagane, ale niedostarczone
Mikrowirówka, mieszadło vortex, roztwór do ekstrakcji.
Uwagi wstępne
Protease Inhibitor Mix nie zawiera EDTA, ponieważ niektóre białka wymagają kationów dwuwartościowych, takich jak Ca2+, Mg2+ lub Mn2+ do swojej aktywności biologicznej. W takich okolicznościach obecność EDTA może być szkodliwa dla aktywności białka próbki.
Próbki można ekstrahować do 8 M mocznika i 4% CHAPS lub do 7 M mocznika, 2 M tiomocznika i 4% CHAPS (patrz roztwory A i B w dodatku I). Podczas ekstrakcji można dodać alternatywne niejonowe detergenty lub inhibitory proteazy. Amfolity nośnikowe (Pharmalytes, Ampholines lub IPG Buffers) mogą być dodawane w stężeniach do 2% dla standardowych protokołów, ale nie powinny być dodawane podczas ekstrakcji białek do znakowania w 2-D DIGE.
- Pozwolić roztworowi ogrzać się do temperatury pokojowej.
- Wirować krótko przed użyciem, ponieważ roztwór jest w postaci zawiesiny.
- Rozcieńczyć Protease Inhibitor Mix 1:100 (10 μl/ml) w odpowiedniej objętości buforu ekstrakcyjnego lub ekstraktu.
Kolejne opcje
- Jeśli wymagana jest wyższa siła hamowania proteaz, dodaj Protease Inhibitor Mix w stężeniu 20-30 μl/ml, aby uzyskać 2-3-krotne stężenie końcowe.
- W celu zahamowania metaloproteaz należy dodać EDTA bezpośrednio w odpowiedniej objętości buforu ekstrakcyjnego lub ekstraktu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM EDTA w reakcji.
EDTA nie może być dodawane, jeśli roztwór ma być stosowany w połączeniu z Nuclease Mix, ponieważ EDTA działa jako inhibitor nukleazy.
A. Roztwór do przygotowania próbki (z mocznikiem) do elektroforezy 2-D
[8 M mocznik, 4% CHAPS, 2% bufor Pharmalyte lub IPG (amfolity nośnikowe), 40 mM DTT, 25 ml]
* W razie potrzeby stężenie mocznika można zwiększyć do 9 lub 9,8 M.
† Inne neutralne lub zwitterionowe detergenty mogą być stosowane w stężeniach do 2% (w/v). Przykłady obejmują Triton X-100, NP-40, glukozyd oktylu i detergenty alkiloamidosulfobetainowe ASB-14 i ASB-16 (Calbiochem).
‡ Amfolity nośnikowe (bufor Pharmalyte lub IPG) i DTT należy wykluczyć z roztworu do ekstrakcji próbek, jeśli próbki mają być znakowane przy użyciu 2-D DIGE. Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcji obsługi Ettan DIGE.
§ Użyj buforu IPG w zakresie pH odpowiadającym zakresowi pH przeprowadzanego rozdziału IEF lub Pharmalyte w zakresie pH zbliżonym do zakresu pH przeprowadzanego rozdziału IEF.
Przechowywać w 2,5 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C.
Uwaga: W razie potrzeby można dodać inhibitory proteazy.
B. Roztwór do przygotowania próbki (z mocznikiem i tiomocznikiem) do elektroforezy 2-D
[7 M mocznik, 2 M tiomocznik, 4% CHAPS, 2% Pharmalyte lub IPG Buffer (amfolity nośnikowe), 40 mM DTT, 25 ml]
* Inne neutralne lub zwitterionowe detergenty mogą być stosowane w stężeniach do 2% (w/v). Przykłady obejmują Triton X-100, NP-40, glukozyd oktylu i detergenty alkiloamidosulfobetainowe ASB-14 i ASB-16 (Calbiochem).
† Amfolity nośnikowe (Pharmalyte lub bufor IPG) należy wykluczyć z roztworu do ekstrakcji próbek, jeśli próbki mają być znakowane przy użyciu 2-D DIGE.
‡ Użyj buforu IPG w zakresie pH odpowiadającym zakresowi pH przeprowadzanego rozdziału IEF lub Pharmalyte w zakresie pH zbliżonym do zakresu pH przeprowadzanego rozdziału IEF.
Przechowuj w 2,5 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?