Alzheimer w naczyniu™: Modele 3D neuronalnych komórek macierzystych choroby Alzheimera

Przegląd sekcji

• Wprowadzenie
• Protokół używany do generowania modeli 3D NSC
• Human ReNcell^®.Protokół używany do generowania modeli 3D NSC choroby Alzheimera
• Human ReNcell^® VM NSC Maintenance and Passaging
• Infekcja wirusowa ludzkich komórek NSC ReNcell^® VM
• Wzbogacanie transgenicznych komórek NSC ReNcell® o wysokiej ekspresji
• Wzbogacanie transgenicznych komórek NSC ReNcell® VM NSCs
• Kultury posortowanych ludzkich ReNcell^® VM NSCs
• 3D Matrix Cultures of Human ReNcell^® VM NSCs
• 3D Culture Cell Seeding of Human ReNcell^® VM NSCs
• Wyniki
• Powiązane materiały

.Wprowadzenie

Technologie hodowli komórek 3D mają na celu zapewnienie ulepszonych predykcyjnych modeli komórkowych do badań, odkrywania leków lub zastosowań w medycynie regeneracyjnej. W przeszłości ludzkie modele komórkowe choroby Alzheimera (AD) in vitro stanowiły wyzwanie ze względu na wysoki poziom rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych toksycznych gatunków amyloidu β (Aβ), które nie odzwierciedlają prawdziwej patologii AD. Niedawno Kim i wsp. stworzyli trójwymiarowy (3D) model ludzkich neuronalnych komórek macierzystych choroby Alzheimera przy użyciu białka prekursorowego β-amyloidu i preseniliny-1 z nadekspresją linii ludzkich neuronalnych komórek macierzystych ReNcell™ VM. Ten model komórkowy 3D był w stanie indukować silne zewnątrzkomórkowe odkładanie amyloidu-β, w tym blaszek amyloidu-β, oraz wysoki poziom fosforylowanego tau w soma i neurytach, a także nitkowatego tau. Model ten jest cennym narzędziem do badania demencji AD związanej z wiekiem.^1,2,3

Linie ReNcell są wysoce opublikowanymi liniami ludzkich neuronalnych komórek macierzystych pochodzących z rozwijających się ludzkich mózgów. Komórki ReNcell^® VM i CX są generowane odpowiednio z brzusznego mezencefalonu i korowych obszarów mózgu i transdukowane czynnikiem transkrypcyjnym myc. Obie linie komórkowe oferują stabilność fenotypu i genotypu, oprócz multipotencjalnej zdolności do różnicowania neuronów i gleju w długoterminowej hodowli.

Protokół używany do generowania modeli 3D NSC choroby Alzheimera

Human ReNcell^® VM NSC Maintenance and Passaging

1. Ogrzewać ReNcell^® NSC Maintenance Media i roztwór Accutase w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez co najmniej 10 minut.
2. Umyć ~95% konfluentnych komórek ReNcell^® VM w kolbie T25 z 3 mL D-PBS, odessać D-PBS i dodać 0.5 mL Accutazy w warunkach bezpieczeństwa biologicznego.
3. Inkubować komórki w inkubatorze 37°C CO₂ przez 3-5 minut, dodać 3 ml wstępnie ogrzanego podłoża ReNcell^® NSC Maintenance Media i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
4. Wirować komórki z prędkością 2000 g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 ml podłoża ReNcell^® NSC Maintenance Media.
   
5. Dozować 4 ml zawiesiny ReNcell^® do każdej kolby T25 pokrytej Matrigelem, a następnie inkubować przez 3-4 dni w inkubatorze 37°C CO₂.
   
   Uwaga: Po podzieleniu (w stosunku 1:3), komórki ReNcell^® zwykle stają się zbieżne po 3-4 dniach. Jeśli w tym czasie komórki nie są zbieżne, należy zastąpić pożywkę świeżą pożywką ReNcell^® NSC Maintenance Media i odczekać 1 lub 2 dni.
   

Infekcja wirusowa ludzkich NSCs ReNcell^® VM

6. Aby przygotować komórki ReNcell^® VM do infekcji, usuń i odwiruj komórki z kolby T25, jak opisano w krokach 1-4. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 12 ml wstępnie ogrzanego podłoża ReNcell^® NSC Maintenance Media i dozować 2 ml zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki pokrytej Matrigelem. Delikatnie wstrząśnij płytką i pozwól komórkom osiąść przez noc.
7. Zastąp podłoże 2 ml wstępnie ogrzanego ReNcell^® NSC Maintenance Media. Gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, dodaj 6 × 10⁶ jednostek transdukujących (TU) cząstek wirusa na studzienkę, aby osiągnąć przybliżoną krotność infekcji (MOI) równą 1. Delikatnie wymieszaj i inkubuj komórki przez noc.

.

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

8. Przepłucz komórki dwukrotnie 2 ml wstępnie ogrzanej pożywki ReNcell^® NSC Maintenance Media, a następnie nałóż 2 ml pożywki. Konfluencja powinna wzrastać wraz z upływem czasu. Ekspresji transgenu można oczekiwać 48 godzin po zakażeniu i powinna być ona wykrywalna za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
   
   Uwaga: Uważnie monitoruj hodowlę. W przypadku zaobserwowania nieprawidłowej śmierci komórek należy natychmiast wymienić pożywkę.
   
   
9. W 4 dniu, jeśli komórki są konfluentne, przeprowadź pasażowanie komórek zgodnie z opisem w krokach 1-5 i wznów normalną hodowlę. Jeśli komórki nie osiągnęły całkowitego zlepienia do tego momentu, wymień pożywkę zamiast pasażowania i inkubuj, aż komórki osiągną zlepienie. Aby wygenerować komórki wyrażające zarówno APPSL/GFP, jak i PSEN1(E9)/mCherry (komórki ReN-mGAP), transdukowane komórki można ponownie zainfekować różnymi wektorami lentiwirusowymi po podziale, jak opisano w krokach 6-8.
10. Weryfikuj infekcję poprzez mikroskopowe wykrywanie fluorescencji GFP i mCherry oraz analizę western blot nadekspresji APPSL i PSEN1(E9). Zazwyczaj 50% zainfekowanych komórek wykazuje widoczną ekspresję markera fluorescencyjnego.
    
    Uwaga:  Zainfekowane, zwalidowane komórki mogą być zamrożone i przechowywane w zbiorniku z ciekłym LN2 co najmniej przez 1 rok przed analizami cytometrii przepływowej.

.

Rysunek 1. Obrazy fluorescencyjne ReNcell VM zakażonych lentiwirusem APPSL-GFP (A) lub PSEN1-RFP (B), MOI = 20. Do 3 dnia po transdukcji wirusowej >80% ReNcell VM wykazuje ekspresję transgenów związanych z chorobą Alzheimera.

Enrichment of high-expressing transgenic Human ReNcell^® VM NSCs

11. Hoduj transdukowane komórki ReNcell^®hVM aż do osiągnięcia konfluencji (95% konfluentna kolba T25 daje ~2-3 × 10⁶ komórek). Chociaż optymalna całkowita liczba komórek zależy od skuteczności infekcji, powinny być dostępne co najmniej 2-3 × 10⁶ pomyślnie transdukowanych komórek (w przypadku oceny za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek lub mikroskopii fluorescencyjnej).
12. Odseparować komórki zgodnie z opisem w krokach 1-4, ale ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml D-PBS. Określić liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
13. Krótko odwirować komórki przy 2000 g w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osady komórek w lodowatej pożywce do sortowania (1 ml na 10⁷ komórek).
14. Aby odseparować komórki, zassać zawiesinę komórek za pomocą pipety 1000uL, delikatnie docisnąć końcówkę do siatki filtracyjnej komórek pod kątem 90° i mocno opróżnić pipetę. W przypadku zablokowania, ostrożnie przesuń końcówkę pipety po siatce, utrzymując nacisk. Zebrać przefiltrowaną zawiesinę w 15 ml probówce do wirowania.
    
    Uwaga: Zawieszone komórki można przechowywać na lodzie co najmniej przez 1 godzinę przed sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją.
    
    
15. Przeprowadź sortowanie komórek aktywowane fluorescencją przy użyciu GFP (488 nm, wzbudzenie 200 mW, emisja 530/30) i mCherry (561 nm, wzbudzenie 150 mW, emisja 610/20) w celu zdefiniowania i posortowania populacji do ostatecznego sortowania zbiorczego. Ustaw bramki, aby wybrać komórki z wysoką ekspresją samego APPSL/GFP, samego APPSL/PSEN1(E9)/mCherry lub razem APPSL/GFP i PSEN1(E9)/mCherry.
16. Natychmiast po sortowaniu umieść komórki na płytkach pokrytych matrycą Matrigel.
    
    Uwaga: Zawieszone komórki mogą być przechowywane w probówce do zbierania komórek na lodzie do 1 godziny przed umieszczeniem na płytce.

Hodowanie posortowanych ludzkich NSCs ReNcell^® VM

17. Wirować komórki z prędkością 2000 g przez 3 minuty w temperaturze 4°C, a następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w podgrzanym podłożu ReNcell^® NSC Maintenance Media (1 ml na 2 × 10⁶ zebranych komórek).
    
    Uwaga: Określić stężenie komórek po ponownym zawieszeniu i odpowiednio dostosować objętość. Nawet zliczanie z sortowania może prowadzić do znacznego przeszacowania.
    
18. Nasiej komórki na 24-dołkowe płytki pokryte matrycą Matrigel w początkowej gęstości 2 × 105 komórek na cm2. Rozszerzaj komórki seryjnie do sześciodołkowych płytek pokrytych matrycą Matrigel, a na koniec do kolb T25 pokrytych matrycą Matrigel. Na tym etapie należy utworzyć wiele hodowli komórkowych. Przeprowadź pasażowanie komórek zgodnie z opisem w krokach 1-5. Gdy zostanie wyhodowana wystarczająca liczba komórek, przejdź do następnego kroku.

Rysunek 2. Klonalne linie ludzkich neuronalnych komórek macierzystych Alzheimera In a Dish™ FAD ReNcell® VM. Alzheimer's in a Dish™ to zastrzeżona kolekcja unieśmiertelnionych jednokomórkowych ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych ReNcell^® VM, które wyrażają stabilne poziomy fluorescencyjnie znakowanych genów AD z wieloma mutacjami FAD. Klonalne neuronalne komórki progenitorowe FAD wydzielają różne ilości całkowitego Aβ i różnią się stosunkiem Aβ42/40. Wszystkie klonalne linie komórkowe FAD wyrażają markery neuronalnych komórek macierzystych Nestin (B) i Sox-2 (C). Na przykład: neuronalne komórki progenitorowe ReN-mGAP10 klonu D4 (SCC008FAD2) zostały podwójnie zainfekowane polikistronicznymi lentiwirusami wyrażającymi APP (Swe/Lon)-GFP, (D) PS1 (deltaE9)-mCherry (E), połączone obrazy (F).

3D Matrix Cultures of Human ReNcell^® VM NSCs

19. Wyjmij matrycę Matrigel z zamrażarki o temperaturze -80°C i umieść ją w lodówce o temperaturze 4°C na 1 dzień przed użyciem.
20. Wyhoduj ~95% konfluentnych komórek kontrolnych i FAD ReNcell^® VM w pięciu kolbach T25 pokrytych Matrigelem. Przybliżona liczba komórek ReNcell^® w kolbie T25 wynosi 3-4 × 10⁶. Zajmuje to zwykle 2 dni po pasażowaniu komórek.
21. Spryskaj wiadro z lodem etanolem i wystaw na działanie promieniowania UV w okapie do hodowli komórkowej przez ~20 minut.
22. Umieść podłoże różnicujące ReNcell^® i Matrigel na lodzie.
    
    Uwaga: Matryca Matrigel ma tendencję do krzepnięcia w temperaturze 10 °C. Rozmroź ją w temperaturze 4°C przez noc, a następnie przechowuj w lodzie do momentu użycia.
    
23. Usuń pożywkę z kolb T25 za pomocą pipety zasysającej. Uważaj, aby nie dotknąć komórek pipetami; zawsze używaj próżni po stronie bez komórek.
24. Umyj komórki raz 3 ml D-PBS na kolbę T25, a następnie ostrożnie usuń je pipetami zasysającymi.
25. Dodaj 0,5 ml odczynnika Accutase™ do każdej kolby i inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez 3-5 minut.
26. Usuń komórki, mocno stukając w bok kolby, aż grudki komórek całkowicie się odłączą.
27. Zawiesić ponownie komórki w 3 ml pożywki różnicującej ReNcell^® i pipetować w górę i w dół wewnątrz kolby co najmniej trzy razy.
28. Przenieść zawiesiny komórek ze wszystkich pięciu kolb T25 do probówki o pojemności 15 ml.
29. Wiruj probówkę przez 2 minuty z prędkością 2000 g w temperaturze pokojowej.
30. Usuń pożywkę za pomocą pipety aspiracyjnej.
31. Zawieś ponownie osad komórkowy w 2 ml zimnej pożywki różnicującej ReNcell^® i worteksuj przez 10 sekund. Umieść 15-mililitrowe probówki na lodzie.
32. Pobierz niewielką porcję zawieszonych komórek i rozcieńcz 1:10 w celu zliczenia komórek (10uL zawiesiny: 90uL pożywki różnicującej).
33. Przelicz komórki za pomocą szkiełka do liczenia komórek; w razie potrzeby rozcieńcz komórki (optymalne stężenie to ~2 × 10⁷ komórek na ml przed dodaniem matrycy Matrigel w stosunku 1:1 w kolejnych krokach).
    
    Uwaga: Pożądane jest osiągnięcie wysokiego stężenia komórek na tym etapie. Stwierdziliśmy, że 1 × 10⁷ komórek na ml (po dodaniu matrycy Matrigel w stosunku 1:1; patrz krok 34) wykazuje silną akumulację APP i p-tau w analizie biochemicznej.

Posiew komórek hodowli 3D Human ReNcell^® VM NSCs

34. Postępuj zgodnie z opcją A dla grubowarstwowych hodowli 3D lub opcją B dla cienkowarstwowych hodowli 3D.
    
    Uwaga: Umieszczenie dużej liczby komórek jest ważne, aby wcześnie uzyskać agregaty APP. Pożądana liczba komórek wynosi 1 × 10⁷ komórek na ml w mieszaninie matrycy Matrigel. Dlatego na tym etapie należy wyhodować wystarczającą liczbę komórek. Ważny jest również numer pasażowania i stan komórek.

(A) Grubowarstwowa hodowla 3D (grubość 3-4 mm)

• Dodaj zimną matrycę Matrigel do zawiesiny komórek na lodzie (rozcieńczenie 1:1 (obj./obj.)). Upewnij się, że końcówki pipet zostały najpierw schłodzone poprzez pipetowanie zimnego medium różnicującego tam i z powrotem przed przeniesieniem matrycy Matrigel.
• Wiruj mieszaninę przez 30 s.
  
• Dozować 300 μL mieszaniny Matrigel/zawiesina komórek do każdego wkładu hodowli tkankowej w 24-dołkowych płytkach za pomocą wstępnie schłodzonych pipet.
  
• Inkubować płytki w temperaturze 37°C w inkubatorze CO₂ przez noc.
• Dodaj wstępnie ogrzane (w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) podłoże różnicujące ReNcell do płytek (1 ml: 500 μL do wkładki i 500 μL do otaczającej studzienki) i umieść je z powrotem w inkubatorze.
  
• Wymieniaj połowę objętości pożywki co 3-4 dni; na początku wymiana pożywki może być konieczna co 2 dni w zależności od koloru pożywki. Nigdy nie pozostawiaj zróżnicowanych komórek do wyschnięcia bez pożywki.
  
• Różnicuj komórki pokryte 3D przez 4-17 tygodni, w zależności od eksperymentów. Leczenie farmakologiczne należy przeprowadzić w ciągu ostatnich 2 tygodni przed analizą punktu końcowego.
  
  Uwaga: Ponieważ nie jest łatwo monitorować hodowlę grubowarstwową pod mikroskopem optycznym, ważne jest przeprowadzenie rutynowego testu uwalniania LDH w celu sprawdzenia stanu hodowli. Zaleca się również utworzenie cienkowarstwowych hodowli 3D z tej samej mieszaniny Matrigel/komórki w celu monitorowania jakości hodowli.

(B) Cienkowarstwowe hodowle 3D (grubość 100-300 mm)

• Dodaj zimną matrycę Matrigel do zawiesiny komórek na lodzie (rozcieńczenie 1:1 (obj./obj.)). Przed przeniesieniem matrycy Matrigel należy najpierw schłodzić końcówki pipety, pipetując zimne podłoże różnicujące tam i z powrotem. W przypadku hodowli cienkowarstwowych na płytkach 96-dołkowych należy dodatkowo rozcieńczyć mieszaninę matrycy Matrigel i komórek w stosunku 1:1, dodając pięć objętości zimnego podłoża różnicującego ReNcell (końcowe rozcieńczenie 1:11) i worteksować przez 30 s. Ta sama szybkość rozcieńczania może być stosowana do cienkowarstwowych hodowli 3D w 8-dołkowych/16-dołkowych komorowych szkiełkach nakrywkowych lub naczyniach MatTek™ ze szklanym dnem.
  
• Nałóż 100 μL mieszaniny matrycy Matrigel i zawiesiny komórek na studzienkę płytki 96-dołkowej za pomocą wstępnie schłodzonych pipet. Jeśli pożądana jest grubsza hodowla 3D, należy użyć dwóch kropli na studzienkę (160 μL przy użyciu pipety wielokanałowej). Objętość 200 μL jest zalecana dla ośmiodołkowych szkiełek nakrywkowych i 300 μL dla naczyń ze szklanym dnem.
• Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO₂ przez noc.
• Następnego dnia dodaj dwie krople wstępnie ogrzanej pożywki różnicującej ReNcell^® do każdej studzienki płytki 96-dołkowej (160 μL przy użyciu pipety wielokanałowej), 200 μL w przypadku ośmiodołkowych szkiełek nakrywkowych i 300 μL w przypadku szalek ze szklanym dnem.
  
• Zmieniaj połowę objętości pożywki co 3-4 dni; na początku zmiana pożywki może być konieczna co 2 dni w zależności od koloru pożywki. Nigdy nie pozostawiaj zróżnicowanych komórek do wyschnięcia bez pożywki. Leczenie farmakologiczne należy przeprowadzić w ciągu ostatnich 2 tygodni przed analizą punktu końcowego.
  
  Uwaga: Różnicowanie ReNcell^® w cienkowarstwowych hodowlach 3D może być ściśle monitorowane za pomocą mikroskopii optycznej i fluorescencyjnej. Niektóre hodowle mogą być utrwalane 4% paraformaldehydem po 2-4 tygodniach i badane pod kątem ekspresji markerów neuronalnych przy użyciu przeciwciał anty-β-amyloidowych (MAB348) i anty-fosfo Tau (AB9668) poprzez barwienie immunofluorescencyjne lub immunohistochemię.

Wyniki

Rysunek 3. A) Barwienie przeciwciałem anty-β-amyloidowym (MAB348) na komórkach z chorobą Alzheimera. Immunoreaktywność jest widoczna jako barwienie na złogach blaszki miażdżycowej (ciemnobrązowe). B) Barwienie przeciwciałem anty-fosfo Tau (AB9668) na komórkach z chorobą Alzheimera. Immunoreaktywność wyraźnie nie jest jądrowa i podąża za długością aksonu neuronu.

Rysunek 4. Analiza agregatów amyloidu w hodowli 3D poprzez barwienie czerwienią Kongo. Klonalne FAD ReNcell NSCs (SCC008FAD2, SCC008FAD3, SCC008FAD5) różnicowano 3D przez 7 tygodni i ekstrahowano łagodnym detergentem. Frakcje osadu (nierozpuszczalne) zawieszono ponownie w PBS, załadowano i utrwalono na szklanych szkiełkach i wybarwiono 1% roztworem czerwieni Kongo (HT60).

Materiały powiązane

Linie komórkowe

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Cząsteczki lentiwirusowe

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Pożywki i odczynniki dla komórek

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Przeciwciała i barwniki

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Dodatkowe linie komórkowe
Numer produktu	Opis
SCC008FAD1	Alzheimer's® In A Dish HReN-mGAP Clone A4H11 NSC Line
SCC008FAD2	Alzheimer's® In A Dish ReN-mGAP Clone D4 NSC Line
SCC008FAD3	Alzheimer's® In A Dish ReN-G2 Clone B2 NSC Line
SCC008FAD4	Alzheimer's® In A Dish ReN-GA2 Clone 3C1 NSC Line
SCC008FAD5	Alzheimer's® In A Dish ReN-GA2 Clone A5 NSC Line
SCC008FAD6	Alzheimer's® In A Dish ReN-mAP3 Clone E6F4 P7 NSC Line
SCC008FAD7	Alzheimer's® In A Dish ReN-mGAP Clone H10 NSC Line

Referencje

1. Kim YH, Choi SH, D'Avanzo C, Hebisch M, Sliwinski C, Bylykbashi E, Washicosky KJ, Klee JB, Brüstle O, Tanzi RE, et al. 2015. A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease. Nat Protoc. 10(7):985-1006. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.065

2. Kim YH, Choi SH, D'Avanzo C, Hebisch M, Sliwinski C, Bylykbashi E, Washicosky KJ, Klee JB, Brüstle O, Tanzi RE, et al. 2015. A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease. Nat Protoc. 10(7):985-1006. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.065

3. Kwak SS, Washicosky KJ, Brand E, von Maydell D, Aronson J, Kim S, Capen DE, Cetinbas M, Sadreyev R, Ning S, et al. 2020. Amyloid-?42/40 ratio drives tau pathology in 3D human neural cell culture models of Alzheimer?s disease. Nat Commun. 11(1): https://doi.org/10.1038/s41467-020-15120-3