Kolumny HPLC Ascentis^® Express RP-Amide

Połączenie fazy stacjonarnej z wbudowaną grupą polarną i cząstek Fused-Core^® Particles

Kolumny HPLC Ascentis Express RP-Amide są najnowszym dodatkiem do linii produktów Supelco HPLC. Łącząc fazę stacjonarną z wbudowaną grupą polarną (EPG) z cząstkami Fused-Core, Ascentis Express RP-Amide zapewnia wiele przydatnych korzyści dla chromatografów HPLC. Zalety technologii fazowej można podsumować następująco:

Zalety kolumny RP-Amide

• Alternatywna selektywność fazy odwróconej w stosunku do C18
  
• Ulepszony kształt piku dla zasad
  
• Kolumna z fazą odwróconą w 100% kompatybilna z wodą

Podczas gdy Ascentis Express C8 i C18 zapewniają klasyczną selektywność fazy odwróconej, faza RP-Amide oferuje alternatywną selektywność. Firma Supelco po raz pierwszy wprowadziła fazę EPG na rynek w 1988 roku. W tym czasie duże współczynniki ogonowania dla podstawowych analitów nadal nękały konwencjonalne fazy związane C18 i C8. Stwierdzono, że faza EPG poprawia kształt piku podstawowych analitów. Wczesna generacja faz EPG opierała się na dwuetapowym procesie wiązania (rysunek 1). Pierwszym krokiem było związanie aminopropylosilanu z gołą powierzchnią krzemionki, tworząc powierzchnię z funkcją aminową. W drugim etapie chlorek palmitoilu reagował z aminą, tworząc amid o długim łańcuchu. Nie wszystkie aminy były przekształcane w tym procesie, pozostawiając układ mieszany. Te fazy EPG wczesnej generacji charakteryzują się słabą odtwarzalnością.

Fazy nowej generacji, w tym Ascentis Express RP-Amide, są wytwarzane w procesie jednoetapowym (rysunek 2). W procesie jednoetapowym nie występują wolne ligandy aminowe, ponieważ amid jest wprowadzany jako cała jednostka. Ten jednoetapowy proces wiązania zapewnia doskonałą powtarzalność między partiami. Co ciekawe, nie wszystkie fazy EPG na rynku wykorzystują nowoczesne, jednoetapowe podejście do wiązania.

Rysunek 1. Dwuetapowy proces łączenia faz amidowych EPG wczesnej generacji

Rysunek 2. Jednoetapowy proces wiązania nowej generacji dla faz amidowych EPG

Poprawa kształtu piku dla związków zasadowych

Jak wspomniano wcześniej, faza Ascentis Express RP-Amide zmniejsza interakcje silanoli z zasadowymi analitami, poprawiając kształt piku. Dobrym testem do zademonstrowania tego efektu są wysoce zasadowe związki przy użyciu fazy ruchomej o pH 7. Przy tym pH wiele resztkowych silanoli jest w postaci zjonizowanej, a związki zasadowe są protonowane.

Protonowane (naładowane) zasady oddziałują z naładowanymi silanolami poprzez wymianę jonową i powodują pik ogonowy. Testową mieszaninę trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych analizowano na kolumnie Ascentis Express RP-Amide i kolumnie C18 o pH fazy ruchomej 7 (rysunek 3). Jak pokazano na Rysunku 3, RP-Amide wytwarza bardziej symetryczne piki niż C18 dla tych trudnych sond testowych. Dane dotyczące asymetrii podsumowano na Rysunku 4 dla doksepiny, imipraminy i amitryptyliny.

kolumny:	jak wskazano; 10 cm x 4,6 mm I.D.
faza ruchoma:	35:65, 14 mM fosforan amonu w wodzie, pH = 7 :  metanol
szybkość przepływu:	1.5 mL/min.
temp.:	35° C
det.	254 nm
wtrysk:	0,5 μL

Rysunek 3. Separacja trójpierścieniowych leków przeciwdepresyjnych za pomocą Ascentis Express RP-Amide i konwencjonalnego C18

Rysunek 4. Współczynniki asymetrii dla trudnych zasad na Ascentis Express RP-Amide i konwencjonalnym C18

Alternatywna selektywność

Ascentis Express RP-Amide zapewnia zwiększoną selektywność dla związków polarnych, zwłaszcza tych, które mogą działać jako donory wiązań wodorowych. Fenole, kwasy karboksylowe, aminy i w mniejszym stopniu alkohole wykazują zwiększoną retencję w fazie RP-Amide w porównaniu do neutralnych, niepolarnych analitów. Przykład siły mechanizmu wiązania wodorowego pokazano na Rysunku 5. Fenolowy charakter katecholi i rezorcynoli stanowi dobry test do wykazania zwiększonej selektywności fazy RP-Amid. Faza RP-Amid wykazuje pełną rozdzielczość wyjściową tych powiązanych związków, podczas gdy faza C18 wykazuje zmniejszoną retencję, rozdzielczość i selektywność dla fenoli. Porównując Ascentis Express RP-Amide z Waters™ BEH Shield RP18, konkurencyjną fazą EPG, selektywność jest bardzo podobna. Różnica w tym przykładzie polega na tym, że Ascentis Express RP-Amide zapewnia ciśnienie wsteczne o połowę mniejsze niż kolumna 1,7 μm. Ta różnica w ciśnieniu wstecznym oznacza, że kolumna Ascentis Express nadaje się do tradycyjnych systemów HPLC, podczas gdy kolumna 1,7 μm nie.

Różnice w selektywności między RP-Amide i C18 mogą być użytecznym narzędziem w opracowywaniu metod. W wielu przypadkach, gdy piki współeluują na fazie C18, RP-Amide można zastąpić w celu uzyskania separacji bez zmiany fazy ruchomej.

kolumny:	jak wskazano; 10 cm x 2,1 mm I.D.
faza ruchoma A:	20 mM kwas fosforowy, pH 2 (nieskorygowane)
faza ruchoma B:	woda
faza ruchoma C:	acetonitryl
stosunki fazy ruchomej:	A:B:C = 75:5:20
prędkość przepływu:	0.3 mL/min.
temp.:	35° C
det.	270 nm
wtrysk:	1 μL
próbka	50 mg/L ea. w 20 mM kwasie fosforowym

Rysunek 5. Separacja związków fenolowych na urządzeniach Ascentis Express RP-Amide i C18 oraz Waters BEH Shield RP18, 1,7 μm

Kompatybilna z wodą kolumna z odwróconymi fazami

Ascentis Express RP-Amide zapewnia stabilną i powtarzalną retencję analitu w 100% wodnych fazach ruchomych. Wiadomo, że wiele faz C18 cierpi na załamanie fazy w warunkach silnie wodnej fazy ruchomej, powodując utratę retencji. Na Rysunku 6 przedstawiono mieszaninę kwasów organicznych analizowanych w 100% wodnych warunkach. Odnotowano doskonałą selektywność i kształt piku dla wszystkich sond testowych, nawet kwasu cytrynowego, który jest notorycznie trudnym analitem.

kolumny:	Ascentis Express RP-Amide, 10 cm x 2,1 mm I.D.
faza ruchoma:	0.1% TFA (v/v) w wodzie
szybkość przepływu:	0,3 ml/min.
temp.	35° C
det.	210 nm
wtrysk:	1 μL
próbka	w fazie ruchomej; kwas winowy, 2 g/L; kwas mlekowy, kwas cytrynowy, 4 g/L; kwas akrylowy, 0.5 g/L; kwas fumarowy, 0,2 g/L

Rysunek 6. Rozdzielanie małych kwasów organicznych w 100% wodnych warunkach

Wnioski

Ascentis Express RP-Amide to połączenie nowoczesnej technologii fazowej i innowacyjnej technologii cząstek. Cząsteczka Fused-Core zapewnia korzyści w zakresie szybkości, rozdzielczości, czułości i wytrzymałości. Jednoetapowa chemia wiązania RP-Amide zapewnia korzyści w zakresie selektywności, stabilności wodnej i ulepszonego kształtu piku dla zasad.