Procedura immunoprecypitacji

Odczynniki i sprzęt
Procedura
Przewodnik rozwiązywania problemów (PDF)

Immunoprecypitacja (IP) jest jedną z najczęściej stosowanych technik immunochemicznych. Immunoprecypitacja, po której następuje SDS-PAGE i immunoblotting, jest rutynowo stosowana w różnych aplikacjach: do określania mas cząsteczkowych antygenów białkowych, do badania interakcji białko/białko, do określania specyficznej aktywności enzymatycznej, do monitorowania modyfikacji potranslacyjnych białek oraz do określania obecności i ilości białek. Technika IP umożliwia również wykrywanie rzadkich białek, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, ponieważ można je zatężyć do 10 000 razy za pomocą immunoprecypitacji.

W metodzie IP białko z homogenatu komórki lub tkanki jest wytrącane w odpowiednim buforze lizującym za pomocą kompleksu immunologicznego, który zawiera antygen (białko), pierwotne przeciwciało i koniugat białka A, G lub L-agarozy lub drugorzędowy koniugat przeciwciało-agaroza. Wybór koniugatu agarozy zależy od pochodzenia gatunkowego i izotypu pierwotnego przeciwciała. Opisane metody są porównywalne, a wybór metody zależy od konkretnego układu antygen-przeciwciało.

Odczynniki i sprzęt

1. Koniugat agarozy: Białko A unieruchomione na Sepharose^® CL-4B (Product No. P3391) lub Protein G-Agarose 4B (Product No. P3296) lub Protein L-Agarose (Product No. P3351) lub koniugat przeciwciało-agaroza (koniugaty przeciwciał drugorzędowych zgodnie z pochodzeniem gatunkowym i izotypem przeciwciała pierwszorzędowego)
2. Przygotowanie lizatu komórek lub tkanek
3. Pierwotne przeciwciało do immunoprecypitacji (patrz specyfikacje produktu) i nieistotne przeciwciało (kontrola negatywna)
4. Odczynniki i sprzęt do PAGE i immunoblottingu 
5. BuforHNTG: 20 mM bufor HEPES pH 7,5 (nr produktu  H4034), zawierający 150 mM NaCl (nr produktu  S9625), 0,1% (w/v) Triton X-100 (nr produktu  X100) i 10% (w/v) glicerol (nr produktu  G9012)
6. Bufor do płukania (lodowato zimny): bufor HNTG lub PBS pH 7,4 (nr produktu  P4417), lub inne bufory (bufor RIPA) zgodnie z wymaganym poziomem surowości płukania
7. Bufor do próbek Laemmli ( np. 1x, 2x (nr produktu. S3401) lub 3x) z lub bez 2-merkaptoetanolu (2-ME (Nr produktu  M7154))
8. Rurki do mikrowirówki (Nr produktu  T9661)
9. Mikrowirówka (Nr produktu. C3361) i wytrząsarka
   

Procedure

Immunoprecypitacja specyficznych antygenów
Metoda A
Metoda B
Przygotowanie do SDS-PAGE

Immunoprecypitacja specyficznych antygenów

Uwaga: Wykonaj wszystkie etapy IP używając probówek do mikrowirówki na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Umyć koniugat agarozy dwukrotnie buforem myjącym, wirować przez 10 sekund przy 12 000xg w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
   Uwaga: Jeśli koniugat agarozy jest proszkiem, odtworzyć go za pomocą dejonizowanego H₂O i pozostawić do spęcznienia na 5 minut.
2. Zawiesić koniugat agarozy w buforze płuczącym (50% zawiesiny).
3. Kontynuuj metodę A lub metodę B, w zależności od potrzeb.

Metoda A

1. Podziel koniugat agarozy na podwielokrotności 50-100 µL (około. 25-50 µL agarozy/objętość złoża) w probówkach do mikrowirówki.
2. Dodaj do każdej probówki 10 µL przeciwciała pierwotnego w odpowiednim rozcieńczeniu (patrz specyfikacje przeciwciała).
3. Inkubować przez 15-60 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając próbkę na odpowiedniej wytrząsarce.
4. Wirować z prędkością 3,000xg przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.
5. Umyć każdą próbkę 1 ml buforu płuczącego, odwirować przy 3,000xg przez 2 min. w 4 °C. Powtórzyć ten krok co najmniej dwa razy.
6. Dodać do każdej probówki 0,1-1,0 ml lizatu komórkowego.
7. Inkubować przez 90 min. do nocy w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając próbkę na odpowiedniej wytrząsarce.
8. Zbierz immunoprecypitowane kompleksy przez wirowanie z prędkością 3,000xg  przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
9. Umyć osad 1 ml buforu płuczącego, odwirować przy 3,000xg przez 2 min. w temperaturze 4 °C. Powtórz ten krok co najmniej 3 razy.

Metoda B

1. Dodaj do próbki lizatu komórkowego (0.1-1.0 mL), 10 µL przeciwciała w odpowiednim rozcieńczeniu (patrz specyfikacja produktu).
2. Inkubować przez 90 min. do nocy w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając próbkę na odpowiedniej wytrząsarce.
3. Dodaj 50-100 µL zawiesiny koniugatu agarozy (około 25-50 µL agarozy/objętość złoża).
4. Inkubuj przez 15-60 min. w temperaturze 4°C, delikatnie mieszając próbkę za pomocą wytrząsarki.
5. Zbierz kompleksy immunoprecypitowane przez wirowanie przy 3 000xg przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.
6. Umyć osad 1 ml buforu płuczącego przez ponowne zawieszenie i wirowanie przy 3,000xg przez 2 min. w 4 °C. Powtórz ten krok co najmniej 3 razy.

Przygotowanie do SDS-PAGE

1. Zawiesić każdy osad w 25-100 µL buforu do próbek Laemmli do końcowego stężenia 1x bufor do próbek. Ogrzewać próbki w temperaturze 95°C przez 5 min.
2. Wirować przez 30 sek. przy 12 000xg w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatant (próbka IP). W razie potrzeby (i jeśli pozwala na to stabilność białka) próbki IP mogą być przechowywane w buforze do próbek w temperaturze -70 °C.
3. Przeprowadź próbki i wzorce MW o znanych stężeniach na SDS-PAGE (odpowiedni procent żelu poliakrylamidowego jest zgodny z wielkością cząsteczkową białka).
4. Transfer na nitrocelulozę i wykonaj immunoblotting.

Odniesienie

1. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. . Laboratory Press New York: Cold Spring Harbor.