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DIG RNA標識キット（SP6／T7）のプロトコルとトラブルシューティング

プロトコル

DIG RNA標識効率の評価：
µg単位で標識効率を判定します（標準的な標識反応の予想収量は、DIG RNA標識反応後の線形化されたテンプレートDNA 1 µgあたり20 µgのDIG標識RNAです）。
Rocheは、アガロースゲルに分取サンプルをロードすることを推奨しています。RNA転写産物は、アガロースゲル電気泳動（例：ホルムアルデヒドゲルやネイティブゲル）とエチジウムブロマイド染色を使用して分析できます。

注記：ゲル電気泳動ではRNAプローブの長さを検証することはできますが、定量化は行えません。

発現ベクターにサブクローニングすることなく、PCR産物からDIG標識RNAプローブを直接生成することは、
適切なRNAポリメラーゼプロモーター配列がPCRプライマーに直接含まれている場合に可能です。
詳細な実験プロトコルについては、添付の Technical Tip を参照してください。

テンプレートの特性：
転写反応における環状または断片化プラスミドDNAは、転写を妨害し、効率を低下させ、非特異的な転写物を生成する可能性があります。制限酵素消化が完全であることの確認には、精製されたプラスミドDNAのみを使用するのが最適です。最良の結果を得るため、高純度プラスミド分離キットを使用してください。DNA 1μgあたり10ユニットの制限酵素を使用し、少なくとも3時間消化します。テンプレートが高純度であり、塩、タンパク質、RNAseなどの汚染物質を含んでいないことが非常に重要です。最良の結果を得るには、直鎖状のテンプレートをゲル精製し、スピンカラム（高純度PCR産物精製キット）を使用してさらにクリーンアップします。または、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿を実行することも可能です。テンプレートDNAをRNAseフリーの水（水、PCRグレード）に再懸濁し、ゲル上の分取サンプルのサイズ、純度、濃度を確認し、1 µgのテンプレートをin vitro転写反応に使用します。

トラブルシューティング

合成されたリボプローブの長さ - ゲル電気泳動での分析 - 複数のバンドが生じる場合の考えられる原因：

可能性1：
非変性条件（単純なアガロースゲル）下では、二次RNA構造が変性されず、2つのバンドが生じることがあります。これを確認するには、MOPS／ホルムアルデヒドゲル（ノーザンブロットゲルで一般的に使用されます）、またはPAGEを使用します。

可能性2：
RNAプローブの生成に使用されるテンプレートDNAは、DNase消化ステップが実行されなかった場合に、ゲルにロードされたアリコート中にわずかな量で存在します。DIG RNA標識キットに付属のコントロールを使用する場合、キットに含まれるDNA断片の詳細については、添付文書を参照してください。

可能性3：
使用するDNAコンストラクトに応じて、5'オーバーハングを線形化に使用できることが推奨されます。
DIG標識反応後に、ゲル電気泳動で結果をチェックし、転写産物が予想されるサイズになっていることを確認します。DNA配列の中には、RNAポリメラーゼによって異常な転写物や短い転写物が生成される原因となるものがあります。これらの問題を解決するには、ポリリンカーが反対方向のベクターに再クローニングし、同じDNA鎖を別のRNAポリメラーゼで転写するか、テンプレートDNAのもう一方の鎖を転写します。

3'オーバーハングまたは平滑末端を持つDNAテンプレートは、「run on」転写によって引き起こされる「間違った」DNA鎖の不要な転写物を生成する可能性があります。この問題を避けるため、5'オーバーハング末端を生成する制限酵素を使用してください。