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Rapid DNA Ligation Kitのプロトコル

Rapid DNA Ligation Kitの概要

Rapid DNA Ligation Kitには、ライゲーションに必要なすべての試薬が含まれています。本キットは、15～25℃でDNAを平滑末端または突出末端のいずれかと連結することができます。反応液中のDNA濃度に応じて、ライゲーション産物は環状（DNA濃度が低い場合）またはコンカテマー（DNA濃度が高い場合）のいずれかになります。ライゲーションしたDNAは、形質変換実験における直接使用に適しています。

Rapid DNA Ligation Kitのプロトコル

クローニング実験を成功させるには、Rapid DNA Ligation Kitを使用するためのガイドラインとして、ここに示す処理手順に従ってください（11635379001）。

注記：クローニング実験では、さまざまな産物が使用されます。Rapid DNA Ligation Kitのリガーゼ酵素はそのうちの1つにすぎません。実験を成功させるには、各ステップに適切なコントロールを使用して、クローン作成ワークフロー全体を最適化する必要があります。

DNAライゲーション調製

ベクター／インサートのDNA純度：高純度のDNAを使用します。High Pure PCR Product Purification Kitまたは塩化セシウムグラジエント精製の使用をお勧めします。Miniprep DNAには、ライゲーション効率を低下させる不純物が含まれている可能性があります。

ベクター／インサートの調製：制限酵素にはヌクレアーゼ汚染が含まれていてはならず、スター活性も防ぐ必要があります。スター活性を起こしやすい酵素を使用して二重消化を行う場合は、Roche制限酵素ポスター（またはRoche Applied Scienceカタログ）を参照して、特定の酵素の組み合わせに最適なバッファーを選択してください。二重消化を行う場合は、可能な限りバッファーHを使用してください。

脱リン酸化：自己環状化を防ぐため、ベクターDNAを脱リン酸化します（再環状化を除く）。特に不活性化ステップでは、アルカリホスファターゼの使用に関する指示に厳密に従ってください。アルカリホスファターゼは、EGTAの存在下で不活性化し、65℃まで10分間加熱した後、フェノール処理とエタノール沈殿を行う必要があります。スピンカラムをはじめとしたその他の手順は効果的ではありません。アルカリホスファターゼは非常に安定した酵素であり、添付文書に記載された処理を行うことで、完全に不活性化できます。

DNA保存バッファー：Rapid DNA Ligation Kitには、DNA希釈バッファーが付属しています。ライゲーション用のDNA濃度を調製するには、このバッファーを使用します。DNAの再懸濁には、EDTAの含有量が0.1 mM以下のバッファーを常に使用します。EDTAはリガーゼが補因子として必要とするMg²⁺イオンと複合体を形成するため、EDTA濃度が高くなると、リガーゼ活性が阻害されます。最良のオプションは、10〜50 mM Tris（pH 7.5～8）を含んだTrisバッファーを使用することです。

ライゲーション

DNAバッファー：ライゲーションするDNAを溶解するには、このキットに付属のDNA希釈バッファーを使用します。または、EDTA濃度が非常に低い（最大0.1 mM）バッファー、あるいは可能であればEDTAなしのバッファーにDNAを溶解します。

DNA量：5分間でライゲーションするDNAの最大量が200 ngを超えてはなりません。

反応液量：Rapid DNA Ligation Kitの場合、反応液量は合計20 µLに制限されます。それよりも容量が大きい場合は、反応時間を最大30分延長する必要があります。反応液中のその他すべての試薬の量も、それに応じて増やす必要があります。

注記：プラスミドベクターの場合は、20 mLの反応液量でDNAが200 ngを超えないようにしてください。そうしないと、高度に鎖状化されたライゲーション産物が得られ、環状化が抑制されます。

ライゲーションバッファー：Rapid DNA Ligation Kitを使用する場合は、使用直前にバイアル1と2の内容物を完全に混合しておくことが不可欠です。

T4 DNAリガーゼの不活性化：原則として、T4 DNAリガーゼは、65℃で10分間インキュベートすることで不活性化できます。この熱不活性化ステップは、ライゲーション混合物を形質転換以外の実験で使用する場合にのみ実行してください。形質転換／パッケージング前のライゲーション混合物の熱不活性化は、形質転換体／プラークの収量の劇的な減少（20分の1以下）につながります。

ライゲーション混合物の保存：後で形質転換を行う場合は、ライゲーション混合物を－15〜－25℃で保存します。

ベクター：インサート（プラスミドベクター）のモル比：Rapid DNA Ligation Kitの場合、粘着末端のライゲーションを行うには、ベクターとインサートのモル比を1+1、1+2、1+3にするか、1+5にすることをお勧めします。平滑末端ライゲーションでは、1+3よりも高いモル比を使用すると効率が低下します。

次の表に一般的な結果を示します。

突出末端のモル比	平滑末端ライゲーション	末端ライゲーション
1+1	3.6 x 10⁶	2.4 x 10⁶
1+2	3.3 x 10⁶	3.0 x 10⁶
1+3	6.8 x 10⁶	1.5 x 10⁶
1+5	1.8 x 10⁷	7.6 x 10⁵

これらの値は、Hanahan法に従って調製された大腸菌JM83コンピテントセルを使用して得られました。ライゲーション混合物の10分の1のみを形質転換に使用しました。

形質転換で使用されるDNAの量

Hanahan法で作製される細胞は過剰量のDNAに敏感です。つまり、ライゲーション混合物全体が形質転換された場合、形質転換体の数が次のように減少しました。

モル比	突出末端ライゲーション	平滑末端ライゲーション
1+1	2.6 x 10⁶	3 x 106

塩化カルシウムで処理された細胞には、過剰な量のDNAに対してより高い耐性があります。

λベクターへのクローニング：λベクターへのクローニングには、8 + 1のモル比が最適であることがわかっています。

注記：λベクターにクローニングする場合は、コンカテマーの形成を促進するために大量のDNAを使用する必要があります。

形質転換

大腸菌コンピテントセルは、いくつかの方法で調製できます。各プロトコルは、難易度、使用する試薬、達成される形質転換効率の点で異なります。最も一般的な2つの方法について、以下で簡単に説明します。

塩化カルシウム法：大腸菌細胞を外来DNAの取り込みに適したものにするものとして発表された最初の方法です。また、塩化カルシウムバッファーのみを使用しているため、最も簡単な方法でもあります。

大腸菌細胞は、対数増殖期の初期から中期まで増殖した後、氷上の塩化カルシウムバッファー内でインキュベートされます。最大効率は、DNA 1マイクログラムあたり1 x 10⁶～1 x 10⁷の形質転換体です。形質転換実験で最大の効率を達成するには、次のガイドラインに従ってください。

– 細胞は常に氷上に置いてください。

– あらかじめバッファーを氷上で冷やします。

– 冷却（－20℃）したピペット（ガラスまたはプラスチック）、チップ、および遠心管を使用します。

– 形質転換バッファーと接触した細菌は、接触したのが遠心分離機への輸送中であっても、常に氷上で保管してください。

– 遠心分離機を4℃に冷却します。

– コンピテントセルを直接使用するか、30〜50%グリセロールの存在下で－70℃で保存します。細胞は効率を低下させることなく、氷上で約半日保管できます。

– Rec Aマイナス株の活性は、保存中に減少することに注意してください。

– 清潔なガラス器具とプラスチック器具を使用してください。

Hanahan法

Hanahan法はより複雑なバッファーを使用するため、極めて高純度の試薬を使用することが重要です。特にDMSOが重要となります。基本的な取り扱いは、塩化カルシウム法と同じです。DNA 1マイクログラムあたり1 x 10⁷～1 x 10⁹の範囲の形質転換効率が得られます。前述したとおり、試薬の純度は重要です。形質転換には、ライゲーションアッセイの10分の1の量のみを使用する必要があります。これらの細胞は、過剰量のDNAに対して非常に敏感です。

コントロール

次のような適切なコントロールを実行することが非常に重要です。

切断されていないベクターDNAの形質転換（例：50ピコグラム）。結果はDNA 1マイクログラムあたりの細胞の形質転換効率を示します。
ライゲーションされていない直鎖状のベクターDNAの形質転換。制限酵素切断の完全性。
再ライゲーションされた脱リン酸化ベクターの形質転換。結果は脱リン酸化の効率を示します。
直鎖状のベクターと再環状化されたベクターの形質転換。結果はライゲーションの効率を示します。
DNAを使用しない、たとえばDNAバッファーのみを使用した形質転換。結果はコンピテントセルのコントロールを示します。つまり、増殖がない場合は、細胞が汚染されていないか、すでにプラスミドを含んでいることを意味します。各選択培地での増殖は、細胞が汚染されており、すでにプラスミドを含んでいることを示しています。

M13のクローニングと形質転換のガイドライン

M 13クローニングで使用される株は、M13の受容体であるF線毛を確実に発現させる、F'プラスミドの特殊な遺伝子構成を有します。菌株はそれぞれ、最小培地で増殖させるか、菌株構成に応じて抗生物質含有培地で増殖させてから、形質転換のために播種し、菌株が引き続きF'プラスミドを含んでいることを確認する必要があります。形質転換のためには、菌株が初期から中期の対数増殖期にあることが重要です。各菌株が対数増殖期の後期または定常期にある場合は、F線毛がある程度失われている可能性があるため、細胞の表面に受容体が存在せず、非常に小さいプラークが得られる可能性があります。

プラスミドベクターへの迅速なDNAライゲーションに関する重要な情報

Rapid DNA Ligation Kitでは、再ライゲーションされたpUC18ベクター1 µgあたり1 x 10⁶以上の形質転換体（突出末端および平滑末端）が保証されています。つまり、わずか2.96 pgのベクター（pUC 18の1分子 = 2.96 ag [アトグラム]）を再ライゲーションして、形質転換体でこの収量を得る必要があります。Rapid DNA Ligation Kitを使用すると、この再ライゲーション率を5分で簡単に達成できます。

注記：これは、アガロースゲルを使用してライゲーション産物を確認した場合、使用されたベクターDNAの相当な割合が「ライゲーションされていない」状態で出現することも意味します。このことは、上記のpUC 18の分子量を考慮すると、容易に想像できます。

λベクターを用いたクローニングにおける連結体ライゲーションの速度とキネティクスは、プラスミドライゲーションとはまったく異なります。連結体のライゲーションでは、リガーゼは大量の DNA の存在下で直鎖状のフラグメントを結合する必要があります。プラスミドクローニングの場合は、まず、直鎖状にされたプラスミドベクターの一端にインサートをライゲーションし、次に同じプラスミドDNAのもう一端をインサートに接続する必要があります。