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Klenow 酵素プロトコル

Klenow 酵素(製品番号KLEN-RO)は、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を持つDNA依存性5'→3'ポリメラーゼです。天然酵素がもつ5'→3'エキソヌクレアーゼ活性はありません。dNTPからDNAの3'-OH末端へのモノヌクレオチドの付加が触媒されます。この特性は、一本鎖DNAテンプレートに相補的なDNAを合成するために使用されます。

Klenow 酵素の使用プロトコル

  1. 20 µLの反応では、制限酵素で0.1〜4 µLの反応液を消化します。
  2. 0.5 mMの各dNTPを1 µLを添加します。
    注記:通常、Klenow 酵素を添加する前の制限酵素の不活性化、バッファーの変更、DNAの再精製は必要となりません。それでも問題が発生する場合は、バッファー条件をSURE/CutインキュベーションバッファーM(f.c. 10 mM Tris、10 mM MgCl ¬2、50 mM NaCl、1 mM DTT、pH 7.5)に調整してみてください。
  3. 1〜5 UのKlenow 酵素を加え、30℃で15分間インキュベートします。
  4. 75℃で10分間加熱するか、1 µLの0.5 M EDTAを加えて、反応を停止します。
    複数の異なる制限酵素による切断によって作製される制限酵素断片の場合は、一端を選択的に修復することが可能です。これを行うには、酵素1で切断し、末端を修復して、Klenow 断片を熱で(75℃で10分間)不活性化してから、酵素2で切断します。
    注記:5'伸長の修復はKlenow のポリメラーゼ活性によって行われるのに対し、3'伸長の修復は3'->5'エキソヌクレアーゼ活性によって行われます。エキソヌクレアーゼは比較的不活性であるため、3'末端にあるオーバーハングの大規模な修復が必要な場合、この方法は望ましくありません。このような状況では、T4 DNAポリメラーゼが推奨されます。
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